白貓計劃匯總十篇

序論：好文章的創作是一個不斷探索和完善的過程，我們為您推薦十篇白貓計劃范例，希望它們能助您一臂之力，提升您的閱讀品質，帶來更深刻的閱讀感受。

篇（1）

此番銀基牽手茅臺被業內解讀成豐富產品線，尋找新的盈利增長點，因為銀基2012年中期財報披露，其凈虧1.77億港元，有近13億港元的應收賬款，營收同比下降85.4%。2011年同期，公司收入則高達16億港元，有4.07億港元的凈利潤，這是銀基在香港上市4年以來提交的首份虧損財報。這種解讀是正確的，但銀基的虧損僅僅是其與茅臺合作的誘因，而不是根本原因，根源在于銀基所經銷的五糧液系列、國窖1573系列、汾酒系列海外市場拓展不利，而海外市場拓展不利的根源在這些品牌的酒文化不被國外市場認同。因此，我認為銀基牽手茅臺折射出的是中國白酒的文化困局。

多年來，中國白酒拓展海外市場效果很不理想，這是公認的事實。并不是西方人不喝酒，也不是他們不習慣白酒的口感，而是不認可白酒的文化。洋酒在中國的成功證明了口感不是問題，文化才是根本。

筆者做過幾次市場調研，喝洋酒的人，65%以上其實并不認為洋酒比白酒更好喝，他們喝洋酒不是沖著其口感，而是文化。比如，在北京經常出現這樣的現象：中午在飯店喝白酒，晚上到夜店喝洋酒。如果在夜店喝白酒就會覺得怪怪的。是文化在背后起了作用。

酒是精神價值與物理價值高度統一的特殊商品，與其物理價值相比，酒的精神價值更加重要，而所謂的精神價值，主要是由酒文化構建和支撐的。因此，酒類品牌都在致力于打造自己的獨特酒文化。白酒品牌也不例外。

但事實上，中國白酒的酒文化存在致命的缺陷。

一、白酒文化的根是農耕文明，不符合工業化、城市化大潮流

白酒已有幾千年的歷史了，但從儀狄造酒算起，或者從杜康釀酒開始，漫長的白酒發展史就是一部農耕文明發展史。在世界上最大規模農耕文明的養育下，中國白酒積淀起深厚的農耕文化氣質。這種酒文化滲透到人們生活的方方面面，徹底與中國人的生活融為了一體。

但今天，中國進行著世界上最大規模的人口大遷徙，成億的人口從農村走進城市。中國經濟的重心也早已從農業轉移到工業，并正在向服務業轉移。同時，我們正趕上第三次工業革命，這次科技革命不僅極大地推動了人類社會經濟、政治、文化領域的變革，而且也影響了人類生活方式和思維方式，使人類社會生活和人的現代化向更高境界發展。同時，第三次工業革命讓世界變成了地球村，信息融通更加便捷。在這樣的時代大背景下，統治中國的文明正由或者已經由農業文明變為工業文明，由農村文明變為都市文明。

做企業的都知道一個基本原則：隨需而變。不同的文明孕育不同的文化，時代變了，市場需求自然也發生了變化，白酒文化自然也應該隨之而變。但事實上，絕大部分的白酒企業依然走在農耕文明的老路上，依然在挖掘歷史，依然試圖用幾百年前乃至幾千年前的歷史人物或故事去征服今天的消費者，在國內這么做，在國外仍然這么做。落后的文明自然會遭到先進文明的強烈排斥和打壓，所以中國的白酒很難受到西方社會的認可。其實這點道理很容易想明白，即便僅僅是國內市場也早已經給了我們清晰的答案：文化修養越低的人白酒的消費量越大，文化修養越高的人白酒的消費量越小，白酒的消費量與消費者的文化修養正好成反比，這就是對我上面所言的最好證明。

說到這里，我們就很容易理解為什么綜合素養越高的人越熱衷于洋酒和葡萄酒了。同時，我們也就不難理解為什么白酒企業的營銷總是那么粗放和笨拙了。根本上來說，白酒在國際市場上的失利是酒文化的失利，而不是口感、渠道和價格的失利。

二、白酒文化缺乏時尚基因

白酒表面的喧嘩掩蓋不了其守舊的本質，固守過去就意味著對現在的放棄，而現在就是與時俱進，就是時尚。

毫無疑問，這是一個比以往任何時候都更強調時尚的年代。追隨時代的步伐，透析當下人們的價值觀，并用產品和品牌去迎合和滿足這種價值觀需求，這就是時尚。在都市文明占統治地位的時代，在個性化成為標簽的時代，白酒依然用農耕思維做產品和品牌，不懂時尚、不夠時尚就是必然的了。

說到這里很多白酒企業會很不服氣，特別是那些銷量巨大的品牌。其實從白酒的產品和品牌傳播中是很容易看到不夠時尚這一缺陷的。

白酒的產品包裝一個比一個奢華，但這種奢華總是透射著封建社會的審美觀，總是帶有強烈的暴發戶的痕跡，生硬而膚淺。顯得與時代格格不入。

品牌傳播不是注重品牌文化的體驗，而是過分依賴廣告投入，依賴高度同質化的促銷，依賴不太體面的買店等惡性手段。而時尚恰恰是一種身心體驗，而不是廣告和促銷所能引導的。

這些都導致了極其嚴重的同質化競爭。

時尚和個性是一個硬幣的兩面，一個懂得時尚的品牌必然是一個充滿個性的品牌，而時尚和個性恰恰是同質化競爭的天敵。要想讓品牌具備時尚和個性氣質，必然要走差異化的競爭路線，就像芝華士和黑牌、馬爹利和軒尼詩一樣。

不夠時尚的白酒為什么在國內還能如此暢銷？這個問題很好回答：一方面是幾千年的消費慣性在起作用，這種慣性不是短期內能徹底改變的；一方面是有很大一批人處于兩種文明的過渡真空期，這批人還沒有形成或正在形成新的價值觀，對時尚并沒有什么深刻的理解，因此，白酒是否時尚對他們影響也不大。

三、不少企業對酒文化的理解有方向性偏差

不管大事小事，要想把事情做好，首先得理解這個事情的基本概念。比如想把人做好，就得理解人是什么，人為什么活著；想把品牌做好，就得搞明白品牌是什么，品牌對企業的價值是什么。同樣，想打造極具市場影響力的酒文化，就得弄明白酒文化到底是什么，和消費者有什么關系，這種關系是怎樣發生的。太多的企業認為這些問題過于簡單而不去深入思考，恰恰是這種漠視，影響了企業對酒文化的判斷和理解，最后出現方向性偏差。

誤將酒文化等同于品牌文化

白酒的酒文化是一個復雜的系統，包含了太多的東西，但只有一個點是和消費者發生著直接的關系，就是酒文化所代表的價值觀，這個嚴格意義上來說應該是品牌文化。品牌文化和酒文化最大的區別是：品牌文化是個市場化概念，它生發于消費者內心，是基于營銷和競爭而生的；酒文化卻不那么單純，其構成的復雜性決定了它往往脫離市場而成為一種空幻的概念。

在賣方市場下可以不考慮品牌，因為消費者沒得選擇。但在買方市場下，不考慮品牌只有死路一條。在對品牌的理解上，白酒業與軟飲料、電子、汽車等行業有著很大的差距。厘清品牌文化與酒文化之間的關系應該是白酒企業的首要任務。

誤把釀造文化等同于品牌文化

釀造文化生發于生產，而品牌文化生發于市場，這是完全反方向的兩個東西。我們看到不少企業喜歡拿釀造文化混同于品牌文化，最典型的就是搞出越來越多的香型。事實已經證明，這些花里胡哨的香型并不被市場買賬。消費者關注的焦點并不是你的酒是怎么釀造出來的，而是你的酒是不是稱了他的心，也就是你的品牌是不是和他有共同語言，價值觀是否相同。釀造文化可以作為品牌文化的支撐點之一，用以幫助消費者更好的理解品牌文化，但絕不能等同于品牌文化，這將會給企業發展帶來巨大阻礙。

誤把歷史等同于品牌文化

把歷史等同于品牌文化是白酒業的又一大特色。在中國，掘歷史的墳墓最徹底的不是小說家，不是電影人，不是史學家，而是白酒企業。不管大小，每一個白酒企業都能說出一大堆的歷史故事。但真正能流傳開來的卻極少極少，如果放到大眾消費者身上，能流傳的白酒故事恐怕也只有“李白斗酒詩百篇、牧童遙指杏花村”等進了教科書的可憐的幾個了吧。

歷史的車輪是滾滾向前的，關注今天和明天是人們的常性，關注過去只是生活的附帶，即使僅僅是附帶的回顧一下歷史，也是為了更加清楚的認識現在和未來。如果一個企業把歷史當做自己關注的主要焦點，必然會忽略對現在和未來的解讀。這或許是白酒品牌多缺乏時尚感和國際競爭力的根源吧。

篇（2）

1引言

轉鐵蛋白（Trf）是脊椎動物體中一種非血紅素結合鐵的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受體結合，內吞化形成內吞小體。在特定信號介導下，Trf可以通過釋放鐵離子，轉移出細胞膜外。由于惡性腫瘤細胞過度表達Trf受體，因此，通過標記Trf可進行腫瘤細胞的識別、診斷和治療研究[1，2]。量子點作為一種新型熒光材料，近年來在生物成像研究中快速發展，特別是在細胞可視化研究方面[3～11]。量子點用于細胞標記一般需將量子點與靶蛋白偶聯，再通過靶蛋白結合在細胞膜或進入胞內顯示量子點的熒光，由此進行靶蛋白在細胞膜及胞內的定位及成像分析。因此靶蛋白與量子點的偶聯體系的構建是量子點生物成像應用的基礎。

本研究選取Trf為靶蛋白，通過其與細胞膜上的Trf受體結合，進而轉運靶蛋白量子點的偶聯物。目前，量子點與蛋白質的偶聯多采用生物素親和素法、共價法及靜電吸附法等。蛋白質與量子點偶聯時，二者的混合比例決定偶聯產物的質量以及生物功能化的效果。在量子點與蛋白質的偶聯反應中建立高效、快速、低成本方法進行表征，對于偶聯體系的優化，提高偶聯效率非常必要。本研究利用毛細管電泳激光誘導熒光法（CELIF）的高效、快速、高靈敏和樣品用量少等優勢，對Trf與量子點CdTe偶聯的方法和條件進行快速優化，并將得到的CdTeTrf偶聯物不經分離而直接用于Hela細胞標記。通過激光共聚焦顯微鏡進行標記效果的成像觀察。實驗結果表明， CdTeTrf偶聯物具有Trf的生物功能，并能特異性識別細胞膜表面的Trf受體，在其介導下可轉運到Hela細胞內，分布在胞質中。CELIF法也適用于其它熒光納米材料的表面功能化效率表征，包括偶聯劑種類的選擇和反應比例的優化、偶聯產物的性質表征等，具有一定的通用性。

3結果與討論

采用CELIF進行偶聯條件優化可得到偶聯產物的定性與定量信息，如荷電性質、荷質比、熒光強度、穩定性等，有助于最佳條件的判斷和選擇。

3.1偶聯劑活化后量子點的表征

因所用量子點是以巰基乙酸為穩定劑在水相中合成而得，故量子點表面包覆著一層羧基，而量子點與Trf的偶聯則通過量子點表面的羧基與蛋白質表面的氨基間的酰胺反應完成。NHS和EDC為常用的亞胺偶聯劑，實驗中對比了以NHS及NHS和EDC混合偶聯劑（EDCNHS）活化的量子點性能（圖1）。

由圖1a可見，以單一偶聯劑NHS活化的量子點其熒光強度高且峰形尖銳，說明單一偶聯劑NHS活化的量子點粒徑均一，有利于減少量子點表面缺陷，增強量子點熒光效率。當使用混合偶聯劑活化時，量子點的峰形較寬，峰強度較低（圖1b），說明混合偶聯劑可能導致量子點的穩定性降低，量子點間產生一定程度的團聚。導致其峰高降低，峰展寬。對比圖1a和圖1b可見，單一偶聯劑NHS活化后量子點性能好于混合偶聯劑EDCNHS活化的量子點。因此后續實驗均采用NHS偶聯劑對量子點進行活化[12，14]。

3.2量子點偶聯Trf的條件優化

NHS的存在使Trf可有效的偶聯于CdTe表面，形成類似核殼結構的CdTeTrf偶聯產物。由圖2A第一個電泳圖可見，產物峰（3.3 min）相對于活化后的CdTe（圖1a， 6.3 min）遷移時間縮短，即量子點偶聯蛋白后遷移加快，說明Trf確實已偶聯于CdTe表面，且偶聯產物表面電荷性質以及整體的荷質比更接近于蛋白質的遷移時間（約3.0 min）。因此說明不同Trf濃度下形成的偶聯產物均以CdTe為核，以Trf為殼，呈現為核殼復合物。

隨偶聯蛋白Trf濃度的增加，偶聯產物的熒光強度變化如圖2B。當Trf的濃度低于31.2 olL時，隨Trf的濃度增加，偶聯產物熒光強度明顯增強。說明包覆于表面的Trf對CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，熒光強度越高。但當Trf濃度高于31.2 olL，熒光強度轉而開始下降。說明偶聯反應在31.2 olL時已達飽和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中過量的游離Trf不僅對功能化的量子點有一定的熒光猝滅作用，而且在后續偶聯體系標記細胞時，游離的Trf將與偶聯產物CdTeTrf一起競爭細胞上的Trf受體靶標，嚴重干擾CdTeTrf對細胞表面Trf受體的標記。因此，采用CELIF法對量子點偶聯條件進行優化，簡單快速，可明確判斷蛋白質是否偶聯于量子點表面，更有利于嚴格控制Trf與CdTe的反應比例，提高偶聯效率和細胞標記效果，后續標記時不需要對偶聯體系的產物進行分離純化。由于Trf濃度增高，會使溶液粘度增加，導致電泳峰展寬，因此采用峰面積考察熒光強度變化。

篇（3）

研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達FimA蛋白并進行蛋白純化。為后續實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實驗基礎。

研究方法：1. 以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導fimA表達，通過SDS-PAGE和Western blot來驗證蛋白的表達結果，并進行蛋白表達形式分析。2. 大量誘導表達融合蛋白，用Co2+柱親和層析純化表達產物，通過SDS-PAGE和Western blot來驗證純化產物，純化產物經透析復性后用BCA法蛋白定量試劑盒作蛋白含量測定。

研究結果：1. 經IPTG誘導表達后，工程菌在SDS-PAGE上出現一條新蛋白帶，分子量與預期大小基本一致（約41kDa），IPTG濃度及誘導時間對融合蛋白表達量影響較大：當IPTG濃度為2 mmol/L，誘導時間為3 h時蛋白表達量最大；當IPTG濃度為1 mmol/L，誘導時間為1 h時蛋白表達量最小。6×His-FimA表達產物經SDS-PAGE后，轉移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，而空質粒pET-15b對應位置未見特異條帶。蛋白表達形式分析結果表明表達的融合蛋白位于包涵體中。2. 表達產物經Co2+柱親和層析， SDS-PAGE上出現一致的單一條帶，其分子量大小與預期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產物經SDS-PAGE后，轉移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導表達后相應蛋白位置一致。經BCA法蛋白濃度定量試劑盒對純化后的蛋白質進行定量分析，計算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96 mg/ml。

主要結論：用本課題組前期構建的fimA基因的原核表達質粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導表達后，fimA基因能夠得到正確表達。表達產物經Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標簽的FimA融合蛋白。

1 緒論

慢性牙周炎是導致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國有很高的發病率，嚴重影響國民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續性的，一旦發生，目前的治療手段還不能使牙周組織達到完全的恢復。牙周炎還可能是某些系統性疾病的危險因素。隨著我國經濟的發展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長，對牙周健康狀況的關注日益提高。因此，探索預防慢性牙周炎的有效途徑對于提高國民健康水平具有重要意義。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有極大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術不斷改進，使得疫苗有了廣泛的應用，被成功的用于許多細菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來防治牙周炎也已成為一個重要思路。

慢性牙周炎是一種細菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亞單位，能夠介導Pg對宿主組織的粘附與入侵，以及與口內其他細菌的粘附共聚[1-3]，還能刺激炎性因子的產生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無菌毛的突變菌株則不會造成牙槽骨的破壞。也有實驗發現，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長1290 bp，開放讀框包括1044 bp，編碼347個氨基酸。翻譯后產物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細胞和B細胞的位點、刺激細胞因子產生的位點等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個位點之間可相互交叉或覆蓋。近年來由于分子生物學和免疫學的發展，fimA基因已被克隆和測序，對蛋白質分子中的各個功能區、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據。

根據國內外研究進展，在前期已構建fimA原核表達質粒的基礎上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達FimA融合蛋白，并通過金屬螯合親和層析技術進行純化，為后續實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發用于人類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實驗基礎。

2 文獻回顧

牙周炎是口腔疾病中的常見病和多發病，在我國有很高的發病率[7]。牙周炎累及牙齒數目多，預后差，是造成牙齒缺失的主要原因。隨著我國進入老齡化社會，牙周炎的預防將成為突出的保健問題。世界衛生組織已將牙周組織健康列為健康人的十項標準之一[7]。探索預防和治療這種嚴重危害人類口腔健康的疾病的方法，對于改善我國人民的口腔健康水平，提高人們的生活質量有著重要意義。

大量的實驗研究、流行病學資料和臨床觀察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引發牙周炎的始動因子，是造成牙周組織破壞的必須因素。牙周菌斑中絕大多數細菌為口腔固有菌叢，對宿主無不良影響，僅少數細菌與牙周炎的發生、發展密切相關。其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前獲得公認的一種牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病變區或活動部位最主要的優勢病原菌，而健康齦溝內很少[7， 8]。目前牙齦卟啉單胞菌也是牙周微生物學領域重點研究的厭氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系統性疾病的研究中，血清學、動物模型、細胞培養的研究證實[9-11] Pg感染與心腦血管疾病的發生有關，而且有學者報道[12]Pg的感染與低體重嬰兒的分娩也有關。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占據重要地位，而且與Pg在口腔的定植有關，為Pg的優勢抗原之一。另外，因其具有廣泛的生物學活性而成為牙齦卟啉單胞菌研究的一個熱點。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革蘭氏陰性菌Pg菌體表面的一種彎曲的、單股的絲狀物，長0.3～1.0 μm，直徑為3.5～5.0 nm，遍布細菌表面，多者每菌可有數百根，由菌體表面伸向細胞外。其化學組分是一種蛋白質，與細菌的運動無關。

2.1 菌毛的致病機制 2.1.1 介導Pg附著于口腔

Pg附著于宿主組織表面是其定植于口腔的關鍵，也是其致病的先決條件。Pg可選擇性的直接附著于口腔內特定部位組織的表面，或識別已經附著在組織表面的細菌，然后間接的附著于組織表面。

1）菌毛可介導Pg附著于口腔內各種組織細胞的表面

菌毛可介導Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；唾液中的重要蛋白質成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳鐵轉運蛋白，細胞外基質蛋白（ECM）（如玻連蛋白和纖維連接蛋白）。人細胞外基質蛋白通過與FimA受體配體的結合在細胞外信號轉導中起重要作用。菌毛對基質蛋白有很強的親和力，而且明顯抑制玻連蛋白/纖維連接蛋白與其受體αβ3和配體α5β（在中國倉鼠卵巢CHO細胞株中過度表達）的相互結合。在牙周組織中，菌毛可能通過細胞外基質蛋白受體/配體途徑阻斷細胞外信號轉導。

菌毛還可介導Pg黏附于牙齦上皮細胞、牙周袋上皮細胞、人口腔上皮細胞、人臍靜脈內皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，附著并凝集人或羊的紅細胞等。Umemoto[13]構建了無菌毛的Pg突變株，發現其對人口腔上皮癌細胞的黏附性和侵襲性均降低，接種小鼠后引起牙槽骨喪失的量也減少。其他學者構建了不表達菌毛的Pg缺陷株，發現它們黏附和侵襲人牙齦成纖維細胞[14]、上皮細胞[15]、內皮細胞[16]和樹突狀細胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。這些研究結果說明菌毛在Pg黏附于口腔上皮細胞的過程中起重要作用。

此外，研究發現Pg可黏附于唾液覆蓋的羥基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），這種黏附活動常被作為研究Pg與口腔內唾液覆蓋的各種組織細胞黏附活動的模型。Lee[18]等的研究發現，Pg與羥基磷灰石之間的這種黏附活動需要菌毛參與，而且抗菌毛的抗體能完全抑制這種黏附作用。學者們[14， 16]通過同源重組技術滅活fimA基因后，發現突變株與sHAP的黏附能力降低。這些研究結果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆蓋的口腔內各種組織表面的過程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介導Pg黏附于附著在獲得性膜表面的細菌，間接的附著于組織表面

細菌之間的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。鏈球菌是最先定植于牙齒表面的主要細菌，Pg通過菌毛與鏈球菌細胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）高親合力、高特異性的結合而與鏈球菌發生共聚，這種相互作用在Pg定植于牙周袋的過程中可能起重要作用。此外菌毛還參與Pg與放線菌、福賽氏類桿菌之間的黏附過程。

3）有關黏附機制的研究

現在已經明確Pg黏附于口腔的過程為一種特異性識別過程，菌毛可能為特異性配體，與宿主細胞膜上的特異性受體相互作用[7]。部分Pg菌毛可識別的黏附受體現已明確，如βintegrins[7，19]、上皮細胞的細胞角蛋白14[20]、巨噬細胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通過上皮細胞的βintegrins促進Pg與牙齦上皮細胞的黏附，抗βintegrins的抗體能抑制Pg的黏附和侵襲[19]。Pg菌毛通過單核細胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，誘導外周血單核細胞IL-6 mRNA的產生、細胞因子的分泌、p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬細胞的實驗研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬細胞與Pg菌毛黏附的細胞受體；而且β鏈（CD18）在信號轉導中起關鍵作用。

綜上所述，菌毛可介導Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳鐵轉運蛋白、細胞外基質蛋白；宿主細胞（如牙齦上皮細胞、牙周袋上皮細胞、成纖維細胞、人臍靜脈內皮細胞，巨噬細胞等）；口腔內的細菌（如鏈球菌、放線菌、福賽氏類桿菌）。借助于菌毛黏附于這些物質，Pg可在口腔內進一步定植、侵襲、誘導炎癥反應的發生。

2.1.2 引發炎癥反應和免疫反應

Pg附著于口腔內組織細胞后，其抗原成分和毒性產物等可引發白細胞的趨化、吞噬等炎癥過程，造成表面組織的損傷——其中Pg菌毛能與脂多糖一起激活宿主的防御機制、誘導多種炎性細胞因子的產生；此外細菌及其產物還通過上皮細胞或者細胞間質進入表層下組織，在組織內繁殖，甚至擴散至全身。

1）Pg菌毛的白細胞趨化作用

牙周炎再現了一種重要的中性粒細胞介導的破壞宿主組織細胞的模型。牙周炎的優勢病原菌P生的毒力因子主要就是用于調節中性粒細胞的反應。其中Pg菌毛能誘導多種可趨化白細胞至炎癥部位的細胞因子的分泌。

Pg菌毛可誘導內皮細胞表達趨化因子IL-8（Interleukin-8）和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人臍靜脈血管內皮細胞持續低劑量的表達IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突變株則不能誘導IL-8和MCP-1產生。同時，抗菌毛的特異性抗體也能阻斷上述因子的產生。這些提示IL-8和MCP-1的產生是由菌毛特異性引起的。

IL-8和MCP-1都是誘導白細胞到免疫反應部位的有效的趨化因子。MCP-1又稱單核細胞趨化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作為趨化因子超家族的一個主要成員，可以由機體多種細胞合成和分泌（如人牙齦上皮細胞），是重要的炎性細胞因子，在機體對入侵的病原微生物的炎癥反應和免疫反應中，起重要調節作用。MCP-1的主要生理作用是特異性的趨化中性粒細胞和巨噬細胞向炎癥部位聚集， 同時還有激活巨噬細胞的功能。而且炎癥部位的細胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激機體的免疫細胞及其他細胞表達MCP-1，該過程中所產生的MCP-1能進一步特異性的趨化巨噬細胞和單核細胞向病損部位聚集。中性粒細胞和巨噬細胞向炎癥部位聚集，是炎癥反應中的一個重要過程。巨噬細胞是參與牙槽骨代謝的重要的免疫細胞，被激活的巨噬細胞能產生大量的骨吸收性細胞因子。也有學者認為巨噬細胞是破骨細胞的前體細胞，在破骨細胞分化因子的存在下，體外培養的巨噬細胞可以向破骨細胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一個重要病理特點，是病變進程、發展和愈后的一個重要指標。這些提示Pg菌毛能通過免疫細胞及其他細胞產生的MCP-1間接的趨化巨噬細胞向炎癥部位聚集，增加破骨細胞的數量，促進破骨細胞的分化和成熟，進而促進牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可誘導內皮細胞表達粘附分子ICAM-1、VCAM-1和選擇素（selectin）：Pg菌毛誘導人臍靜脈內皮細胞表達細胞內黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上調上述分子的表達，而Pg 的fimA基因突變株或含有抗Pg菌毛蛋白抗體的血清與人臍靜脈內皮細胞共培養時，不能誘導上述分子的表達。

內皮細胞通過上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可誘導和趨化血液循環中的白細胞黏附至內皮細胞。其中選擇素是血管粘附分子大家族中的一大類成員，根據表達部位可分為三類[21]：表達于活化的內皮細胞表面的E-selectin；表達于白細胞表面的L-selectin；表達于活化的血小板和內皮細胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反應發生過程中，selectin通過與其相應配體結合介導白細胞（中性粒細胞、T-和B-淋巴細胞以及單核細胞等）與血管壁（特別是毛細血管后靜脈）接觸，并使白細胞在血管壁上緩慢滾動，從而啟動一系列反應，最終導致白細胞在炎性反應區域集中。ICAM-1也可促進白細胞黏附、移動和趨化至炎癥部位。血液循環中的單核細胞和白細胞黏附和趨化至內皮細胞，然后穿過內皮細胞在局部聚集是炎癥反應的重要過程。Pg菌毛通過誘導內皮細胞所表達的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趨化單核細胞和白細胞至炎癥反應的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛誘導多種炎性細胞因子的產生

（1）Pg菌毛誘導外周血單核細胞產生炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學趨化因子IL-8，誘導p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化，刺激單核細胞誘導的細胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亞單位的活化（通過TLR信號轉導途徑），從而誘導高滴度的NF-κB依賴性細胞因子的釋放。NF-κB是細胞中一個重要的轉錄調節因子，是Rel家族的成員，幾乎存在于所有細胞中，在免疫反應、應激反應、細胞凋亡及病毒復制的調節中起主導作用，可在炎癥部位高度表達，提示其在免疫反應和炎癥反應中起著關鍵作用。受NF-κB調節的炎性細胞因子有：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒細胞-CSF，粒細胞和單細胞-CSF）；β-干擾素（INF-β）等。因此，NF-κB是多種促炎癥基因高度轉錄的必須因子。同時，由NF-κB調節的產物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，這就意味著存在一個能放大且延續炎癥反應的復雜的調節環路。

（2）Pg菌毛還能通過TLR2信號途徑誘導小鼠腹膜巨噬細胞產生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管內皮細胞生長因子，誘導MCP-1 mRNA的強表達。CD18可能在相關的信號轉導機制中起重要作用。Pg菌毛可誘導巨噬細胞樣細胞株U937表達IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表達的Pg菌株能誘導單核細胞來源的樹突狀細胞表達炎性細胞因子TNF-α、IL-6，免疫調節細胞因子IL-10和趨化因子IL-8，而fimA基因的突變菌株Pg DPG3就不能誘導上述細胞因子的表達。而且用菌毛蛋白刺激單核細胞來源的樹突狀細胞，能在自體混合淋巴細胞反應（MLR）和自體的CD4+ T細胞中誘導以IFN-γ為主要細胞因子的Th1-型免疫反應。

關于菌毛誘導各種炎性細胞因子的產生的機制，Hajishengallis[22]的研究表明：體內免疫系統的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）組成了一種功能性受體復合物，識別并對病原菌相關模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反應。在這種相互作用中，菌毛作為一種病原菌相關模式分子與宿主細胞的模式識別受體復合物相結合。CD14和CD11b/CD18是一種募集性受體，TLRs則是一種信號轉導受體。TLR2和TLR4與介導菌毛活化細胞有關，其他的模式識別受體如CD14和CD11b/CD18與介導細胞對菌毛的識別有關。菌毛通過激活TLR信號轉導途徑，誘導單核細胞產生炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學趨化因子IL-8，并誘導抗原呈遞細胞中協同刺激性分子CD40、CD80和CD86表達的上調。此研究結果也提示菌毛對宿主免疫系統有潛在的“危害”。

3）Pg菌毛誘導多種與調節骨代謝有關的細胞因子的產生，改變牙槽骨的代謝，誘導骨的吸收

Pg菌毛所誘導產生的細胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部調節因子，在牙槽骨的吸收破壞中起重要作用，可促進結締組織基質的降解，刺激骨的吸收，與牙周炎密切相關[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等細胞因子還可通過自分泌和旁分泌途徑，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的產生，使炎癥加重和擴大，引起組織的進一步破壞。提純的菌毛蛋白還能濃度依賴性的誘導肝細胞生長因子HGF/SF的產生。HGF/SF，也名為趨化因子SF，由間充質細胞產生，主要作用于上皮細胞，與刺激破骨細胞的活化有關。

Evans[23]研究發現表達菌毛的Pg能誘導無菌鼠牙槽骨喪失，而不產生菌毛的Pg誘導無菌鼠牙槽骨喪失的能力顯著降低，而且用提純的菌毛蛋白免疫無菌鼠可預防Pg所導致的牙周組織的破壞。這也證實了菌毛與牙槽骨的吸收密切相關。

4）Pg菌毛抑制單核細胞和巨噬細胞的凋亡

單核細胞和巨噬細胞的凋亡可能與慢性炎癥性疾病密切相關。在缺乏生長因子的培養液中，Pg菌毛蛋白可抑制人單核細胞THP-1的凋亡。這種抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗體所完全抑制。菌毛可激活細胞外信號傳導激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激細胞內依賴細胞周期的蛋白激酶抑制劑p21的表達，從而阻斷單核細胞和巨噬細胞的凋亡，提示菌毛可阻斷單核細胞和巨噬細胞的凋亡，是慢性炎癥性疾病牙周病的一種重要的調節分子。

5）Pg菌毛誘導免疫反應

慢性牙周炎與牙齦卟啉單胞菌感染不成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、誘導真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs數量的增加有關。Jotwani[24]的研究證實fimA基因正常表達的菌株Pg381與fimA基因的突變菌株PgDPG3相比，能更高效進入單核細胞來源的樹突狀細胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，誘導DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能誘導高水平的自體混合淋巴細胞反應，誘導Th1-型免疫反應。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能誘導DCs成熟，而且成熟的MDDCs還能誘導自體同源性CD4+T細胞的增殖，γ-干擾素（gamma interferon，IFN-γ）的釋放。這些結果提示Pg菌毛可能在誘導MDDCs吞噬Pg和誘導Th1-型免疫反應中起重要作用。

Amano[25]報導在牙周炎病人體內能檢測到高滴度的抗菌毛的特異性IgG和IgA抗體。Condorelli[26]報導在牙周炎病人71.7%活動性位點和58.7%非活動性位點的齦溝液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能檢測到抗Pg菌毛的特異性IgA抗體，而在健康對照組的所有位點的GCF中均不能檢測到抗菌毛的特異性IgA抗體。這些流行病學研究的結果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在體內誘發免疫反應。

Pg菌毛所誘導的免疫反應具有保護作用：Evans[23]等用提純的菌毛蛋白和一種人工合成的20個氨基酸的菌毛多肽免疫無菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特異性抗體滴度較用全菌免疫后鼠血清中的抗體滴度高3～4倍。當給無菌鼠口腔接種Pg后，菌毛免疫鼠的牙周組織未受到破壞。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍亂毒素CT為免疫佐劑），能在黏膜效應組織（包括鼻腔通道，頜下腺）的CD4+T細胞誘導Th1-/Th2-型免疫反應。而且頜下腺產生的抗原特異性的IgA多克隆抗體可抑制Pg黏附于上皮細胞，減少上皮細胞細胞因子的產生。提示菌毛是一種有潛力的研制牙周炎疫苗的候選免疫原。

6）Pg菌毛誘導泡沫細胞的形成

有學者報導Pg的感染與動脈粥樣硬化[28]的發生有關。動脈粥樣硬化是一種由血管壁開始的慢性炎癥性反應，其中泡沫細胞的形成是其重要特點。Giacona[28]研究證實人體巨噬細胞在感染野生型Pg后，形成泡沫細胞的量明顯增加，但是感染fimA基因的突變菌株Pg DPG3后沒有明顯的變化，提示菌毛是Pg誘導泡沫細胞形成的必須因素，Pg菌毛可能與動脈粥樣硬化的發生有關。

2.2 有關fimA基因表達調控的研究進展

Pg fimA基因的表達途徑有以下三種[29]（按照表達和裝配系統分類）：陪伴/引導分子途徑系統、第二分泌系統、核化依賴聚合系統。fimA基因表達的初始產物具有非常長的前序列。Pg蛋白酶參與fimA基因的翻譯后處理、轉運和裝配[29]。fimA基因的表達還受到以下因素的影響。

1）局部理化環境對Pg fimA基因表達的影響

研究表明[30]，Pg fimA基因的表達及菌毛依賴性表型的活性均受到溫度、離子濃度等環境條件的影響。

齦下區的溫度并不恒定，常隨牙齒部位及炎癥程度而變[31]，健康齦下區溫度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋內溫度　可達39℃。Xie等[32]通過fimA啟動子-lacZ受體基因融合研究環境因素對Pg fimA基因表達的影響時，發現當齦下區溫度由34℃升至39℃時，Pg fimA基因表達可減少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同樣證實溫度升高時，基因fimA的表達水平降低。Amano等[35]報導溫度從37℃提高到39℃時，Pg對唾液成分和鏈球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性發生改變。溫度影響DNA的超螺旋結構，改變組蛋白與DNA結合的活性[36]，從而降低基因轉錄的速度[37]。Pg根據溫度的變化來調整fimA基因表達的水平，可能是在機體感染Pg早期，fimA基因表達水平較高，有利于Pg黏附及侵入牙周組織；隨著炎癥程度加重、牙周袋形成和局部溫度升高，菌毛的產生受到遏制，從而使菌毛的某些功能特性發生改變，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表達還在轉錄水平受氯化高鐵血紅素濃度的調節[38]。鐵在Pg的生長繁殖和毒力中起關鍵作用，Pg以血紅素的形式吸收鐵[39]。McKee[40]等發現，Pg在氯化高鐵血紅素過量時，毒力增強。在氯化高鐵血紅素不足時，Pg生長速度降低，Pg菌體表面菌毛數量減少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表達水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶樣蛋白酶等的數量及其致病毒力均明顯增加[42， 43]。為進一步闡明氯化高鐵血紅素在調節fimA基因表達中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的轉錄活性，結果顯示在缺乏氯化高鐵血紅素的情況下，fimA啟動子活性降低50%，表明氯化高鐵血紅素可以對Pg fimA基因表達起正調控作用。但是這種調控作用不如溫度變化對其影響的程度明顯。雖然在氯化高鐵血紅素缺乏時，Pg的生長速度降低，但此時fimA啟動子活性降低與Pg生長速度的降低并沒有直接的聯系[38]，fimA啟動子的活性并不依賴于Pg的生長階段。氯化高鐵血紅素調節Pg fimA基因表達的具體分子機制仍不清楚，許多受離子調控的基因在其啟動子區均存在“離子盒”，而在fimA啟動子區并沒有與此具有同源性的區域結構[44]。推測可能是由于Pg多種致病因子基因的表達共同受到氯化高鐵血紅素的調節所致。

影響Pg fimA基因表達的局部理化環境還包括血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等。

關于Pg如何感受到環境的變化，并把這種信息傳遞給細胞的機理并不完全清楚。但是研究發現信號轉導系統的兩種成分FimS-FimR與Pg fimA基因的表達有關[45]。FimS是一種組氨酸蛋白激酶基因的等位基因，FimR是反應調節基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂會導致菌毛形成量的明顯降低。fimA基因的表達可能受到FimR反應調節器的正調控[46]。FimR調控包括fimA基因位點周圍的5個成串的基因——fimA cluster在內的多個基因的表達。染色體免疫沉淀反應和電泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一個基因的啟動子區域。突變菌株的基因表達分析表明，fimA基因轉錄過程包括多個步驟，FimR基因上調fimA cluster中的第一個基因的表達，而此基因編碼一個在fimA基因的表達中起關鍵作用的調控蛋白。

2）其他口腔微生物對Pg fimA基因表達的調控

牙菌斑是一種附著了各種細菌的生物膜，這些菌斑微生物之間可以通過細胞間信號轉導機制互相影響。Pg通過與獲得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的細菌如口腔鏈球菌[1]相接觸而定殖于牙菌斑生物膜中，然后與牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于鏈球菌突變株或者S.cristatus這一底層的上面[47]。針對這一現象的進一步研究揭示鏈球菌S.cristatus CC5A能明顯降低Pg的fimA基因的表達水平，其濃度與fimA基因表達水平呈負相關，濃度升高時甚至可使fimA啟動子活性下降1/2[48]。但是，在實驗中尚未發現菌斑中的其他細菌，如纖細鏈球菌G9B和M5、血鏈球菌10556、變形鏈球菌KPSK2、內氏放線菌NC-3、齒垢密螺旋體GM-1以及具核梭桿菌10953等對fimA基因的表達具有這種調控作用[49]。

目前的研究結果認為，S.cristatus CC5A與Pg之間的這種信號轉導開始于Pg受體對CC5A信號的識別[47]。信號分子是鏈球菌S.cristatus細胞膜表面的一種分子量為59kDa的CC5A蛋白，與其他革蘭氏陽性菌分泌的短信號肽有明顯區別[49]。菌毛自身并非受體，fimA基因突變的Pg株與CC5A蛋白的結合與野生型Pg菌株與CC5A蛋白的結合沒有區別。這些結果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的許多細菌并不影響fimA啟動子轉錄的活性，不影響Pg菌毛的產生，因而能夠與Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特異性地使Pg fimA表達水平降低，從而影響菌毛的產生，阻止Pg在菌斑內的進一步的繁殖。

3）Pg自身產物對fimA基因表達的調控

目前，定點誘變試驗表明[50]，在fimA基因上游區域存在一個σ70-識別的RNA聚合酶結合位點，研究證明，調節蛋白能夠與此位點特異性的結合，從而影響RNA聚合酶的功能。Xie等[48]發現有三種蛋白可結合于fimA基因，分別是菌毛蛋白、賴氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻譯后處理片段。

將外源fimA啟動子-LacZ受體插入攜帶fimA突變基因的Pg菌株內，結果發現插入的外源性fimA啟動子不能活化，fimA mRNA表達水平低；但若僅使fimA結構基因上游區域產生突變，則不影響啟動子的活性，fimA mRNA的表達水平與野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表達過程中，表達產物可作為調節蛋白與自身啟動子上游區的RNA聚合酶結合位點結合，從而正反饋性調節Pg fimA基因的表達。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也參與調節fimA基因的表達。有研究[51]報道當rgp表達水平較低時，Pg表面菌毛數量減少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2與野生型Pg相比，fimA mRNA表達水平明顯降低[52]。Pg 381的rgp A基因突變的變異株不表達菌毛，rgpB基因變異菌株表達的菌毛水平較野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也證明rgpA單基因突變菌株的fimA mRNA表達水平下降，表達的菌毛蛋白很少，通過Western印跡分析不能檢出菌毛蛋白，其表面的菌毛通過電鏡也無法觀測到。菌株Pg 33277 的rgpA和rgpB雙基因缺陷變異菌株則不表達菌毛[48]。這些研究結果均證明蛋白酶可在轉錄水平直接影響菌毛蛋白的產生。此外，在菌毛蛋白翻譯后修飾加工的過程中，Pg蛋白酶還參與到對菌毛蛋白N-末端氨基酸的修飾加工。

這些資料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在內的幾種Pg來源的蛋白都是fimA基因表達調控系統的組成部分，它們能夠與fimA基因的上游區域結合，從而影響fimA基因的mRNA表達水平。

綜上所述，影響Pg fimA基因表達的因素有：局部理化環境，包括溫度、氯化高鐵血紅素的濃度、血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等；牙菌斑中的細菌如S.cristatus CC5A；Pg自身產物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能對fimA基因的表達過程詳細研究，在fimA基因轉錄的過程中加以某種干預，使Pg菌毛蛋白的轉錄、翻譯水平降低，或者使fimA基因翻譯后的修飾加工過程受到干擾，使菌毛所介導的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用減少，就有可能降低Pg相關性牙周炎的發病率和嚴重性，這也是未來的一個研究方向。

2.3 有關fimA基因分子克隆的研究進展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并測序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并測序了9種Pg菌株的fimA基因，結果揭示這9種Pg菌株的fimA基因覆蓋1044～1083 bp，所編碼的多肽分子量為37，527～38，239，菌株之間有一部分相同的序列，同時具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照fimA基因核苷酸序列的不同，將Pg分為4種基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表達載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表達載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全長為1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次構建了表達部分菌毛多肽的重組鏈球菌——一種活載體疫苗。以pUC13Bg12.1為模板，將編碼Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90個aa]和C-末端233～322殘基[89個aa]）的基因，PCR擴增后，定向插入到鏈球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位點，獲得融合表達質粒pSMB55，然后轉染于口腔鏈球菌（S. gordonii GP251）中，制備為一種以細菌為載體的基因工程減毒活疫苗。在鏈球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的錨定區，表達菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一種融合蛋白。此鏈球菌所表達的菌毛多肽可競爭性的抑制Pg結合于唾液覆蓋的羥基磷灰石上。而且將此疫苗菌株口腔內免疫無菌鼠后，可誘導血清異性IgA、IgG抗體和唾液異性IgA抗體的產生，并能防止Pg所導致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年進一步在鏈球菌Streptococcus gordonii表面，表達FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是實驗證實這種包含游離半胱氨酸殘基的多肽在鏈球菌的表面表達很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆質粒pSM36為模板克隆了fimA基因，以真核表達質粒pcDNA3首次構建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。體外轉染NIH3T3真核細胞后，可檢測到菌毛蛋白的表達，說明了在真核細胞中表達FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的誘導了體液免疫和細胞免疫，在唾液和血清中能檢測到特異性抗體。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特異性IgG抗體主要的亞類是IgG2a，唾液腺單核細胞Th2-型細胞因子特異性mRNA增加，脾中產生抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞。

Shin等[62]2005年首次報道在植物中表達菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸殘基266～337的編碼基因，然后插入到植物的表達載體中編碼CTB（霍亂毒素B亞單位）的基因片段的下游，然后此嵌合性載體ctb-fimA被轉染到馬鈴薯（Solanum tuberosum）細胞中表達蛋白。通過ELISA對CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表達量較低，尚需要進一步改進。

國內劉魯川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1質粒為模板，PCR擴增fimA基因部分片段（504～1045 bp，總擴增長度為542 bp）。

郭紅梅[64]2007年成功的構建了FimA蛋白與IL-15真核共表達質粒，以其作為DNA疫苗經滴鼻免疫Wistar大鼠，能夠激發　機體產生特異性的系統免疫應答，又能激發粘膜免疫應答。疫苗所表達的IL-15可以作為輔助因子增強sIgA應答，對Pg引起的實驗性牙周炎提供有效的保護，為解決增強sIgA應答來對牙周組織提供保護的難題提供思路。

2.4 有關大腸桿菌表達系統

2.4.1 大腸桿菌表達系統

大腸桿菌表達系統是目前最常用的外源蛋白表達系統[65] 。大腸桿菌系統由于其遺傳學、生物化學和分子生物學方面已充分被人們了解，而且有大量可供選擇的克隆載體與表達載體，已經成為表達許多異源蛋白質的首選表達系統[66，71]。大腸桿菌遺傳圖譜明確，容易培養且費用低，對許多蛋白質有很強的耐受能力，能高水平的表達這些蛋白質。但是，在實際工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表達，以滿足人們各種研究需要。此外，許多外源基因在大腸桿菌胞內表達時，往往不能自發折疊卷曲生成有一定空間結構的特定功能的蛋白質，而是以一種不溶性的沉淀即包涵體的形式存在于細胞內[67 ，68 ] 。包涵體的形成在某種程度上限制了大腸桿菌表達系統的應用。由于處于包涵體中的重組蛋白沒有生物活性，為使重組蛋白具有生物活性，必須將包涵體復性，而包涵體的變性、復性一直困擾著許多科學工作者[69，70] 。

2.4.2 在大腸桿菌中表達外源蛋白的優化[71]

1）翻譯效率的優化：啟動

有效啟動翻譯需要起始密碼上游的核糖體結合位點。翻譯起始過程中，5～9個核苷酸長的Shine-Dalgarno序列與16S RNA的3'末端發生作用。Shine-Dalgarno序列與起始密碼ATG之間的距離對翻譯效率有影響，在ATG下游插入開放閱讀框架的載體，此段距離已經優化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻譯，起始密碼應位于Shine-Dalgarno序列下游5～7個核苷酸。

翻譯起始區的二級結構也影響基因表達效率。Chen等通過改變Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，減少二級結構的形成，提高了基因表達水平。與此類似，也有一些基因通過共翻譯，也就是在一段翻譯序列的下游插入目的基因編碼序列，提高了表達水平。

2）密碼子的使用

遺傳密碼與氨基酸并不是一對一的關系，61種密碼子編碼20種氨基酸，而其中只有兩種是由單一密碼子編碼的，其余的18種中的每一種都有多個密碼子，編碼同一種氨基酸的不同密碼子的使用頻率也是不同的。

如果編碼區中有大量的或成串兒的稀有密碼子，通過突變或基因重合成去除這些稀有密碼子，可以提高表達水平。另外，如果靶序列中有稀有密碼子AGA或AGG，會帶來一些特殊問題，因為它們在編碼區內部又形成額外的Shine-Dalgarno序列。

編碼外源蛋白氨基酸的序列對表達水平也有很大影響。因此有必要用聚合酶鏈反應（PCR）或定點突變的方法，把表達基因N端的7～8個密碼子變成大腸桿菌中最常用的密碼子。還應盡可能通過這些方法將靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培養條件優化

在表達系統相同的情況下，不同的培養基常導致表達水平的巨大差異。LB類標準培養基可以用于建立表達的基本參數，但只有對培養條件進行優化后，才能獲得最佳表達，包括使用基本鹽培養基，如M9，限定鹽培養基，如誘導培養基，或豐富培養基，如肉湯、YT或NZCYM。

一些培養基添加劑能提高某一種特定蛋白的表達水平。這其中包括濃度在0.1～0.5 mol/L之間的NaCl、不可代謝糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、輔助因子（血紅素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途徑缺陷的抑制基因位于與蛋白質合成有關的基因上，這些抑制突變的最終效果是降低蛋白合成速率，而低濃度抗生素能在大腸桿菌中模擬它的作用。表達外源蛋白尤其是分泌蛋白時，在培養基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四環素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系統過載，分泌蛋白也就更容易與伴侶分子等結合，折疊成天然構象。最后，培養基的pH也能影響外源蛋白的表達，當LB培養基的pH降至5.5以下時，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表達量顯著提高。極端pH可能會使細胞生長速率降低，從而防止細菌表達/加工系統過載。

在克隆基因的上游插入強的可調節啟動子和有效的核糖體結合位點，可以在細菌中表達非融合蛋白。融合蛋白能大量制備，易于純化，而且能賦予蛋白新的免疫學或生物學分析反應特性。

2.5 六聚組氨酸融合蛋白的純化

近年來，隨著蛋白質組學研究的發展，基因工程重組蛋白的分離純化技術顯得尤為重要，要將目標蛋白從復雜樣品中快速、特異地純化出來，就需要選擇合適的蛋白純化方法。

融合標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術。融合標簽技術的發展使重組蛋白質的純化更加快速、簡便，并很快得到了應用。目前常用的蛋白純化標簽是GST（谷胱甘肽巰基轉移酶），6×His（六聚組氨酸）和表位標簽（如FLAG是專為蛋白純化和檢測設計的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最為常用，帶有6×His標簽的融合蛋白可利用固定化金屬鰲合親和層析和免疫親和法進行純化。

Porath于1975年首次提出固定化金屬螯合親和層析(IMAC)的概念[72]，該法基于蛋白質表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基與固定化金屬離子的相互作用而對蛋白質進行分離純化。其中，組氨酸是與金屬離子作用較強的氨基酸，含有多個組氨酸的蛋白質可在IMAC中有效保留，故人為設計的多聚組氨酸便成為最常用的蛋白質純化標簽[73]。

免疫親和純化是一種利用抗原抗體特異性可逆結合特性的技術，它具有高效、高收率、濃縮效應等優點。在眾多蛋白質純化技術中，免疫親和純化是十分關鍵的技術。標簽融合蛋白可通過抗標簽的單克隆抗體和多克隆抗體來純化。多數免疫親和純化都使用單克隆抗體，但有兩種類型的多克隆抗體可用于免疫親和純化，即針對合成肽(如6×His、FLAG標簽等)或某種抗原的特定區域產生的抗體。在這兩種情況下，由于結合到固定化抗體上的抗原位點局限在一個很小的區域，因此可實現有效的洗脫。目前已有商品化的特異性針對標簽的單克隆抗體，但價格都比較昂貴。

重組蛋白在大腸桿菌（E. coli）高效表達時，往往以不溶的、無活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細胞內。必須從細胞內分離出包涵體，采用高濃度變性劑（如7.0 mol/L鹽酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復性，最后再用色譜法使目標蛋白質得到純化。其中包涵體蛋白的復性和純化是整個過程中的核心。

2.5.1 融合標簽技術

1）融合標簽技術

融合標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術，其主要過程是利用重組DNA技術在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標簽的編碼基因，通過適宜的宿主來表達重組蛋白質[74-78]，表達的重組蛋白質可以通過融合的標簽與包被在固相基質上的特異配基結合而進行純化。融合標簽技術的發展使重組蛋白質的純化更加快速、簡便。近幾年，隨著新的融合標簽系統的開發，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質純化外，還用于蛋白質定位和檢測等。

2）融合標簽的種類

融合標簽根據其分子量大小可分為兩大類:大的蛋白質分子(或蛋白質結構域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白質標簽有GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(綠色熒光蛋白)等，它的使用會增加目標蛋白的溶解性，但在蛋白結晶和抗體產生等過程中，標簽必須去除。小的多肽標簽有6×His(六聚組氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(專為蛋白純化和檢測設計的八肽)等，多數情況下，由于多肽標簽相對較小，對融合蛋白質結構影響小，不需要從融合蛋白質中切除，因而多肽標簽較蛋白質標簽更為常用。迄今為止，己有文獻較為詳盡地報道了各種融合標簽[79，80]，其大小從幾個氨基酸到蛋白質不等，相互作用類型包括酶與底物、細菌受體與血清蛋白、六聚組氨酸與金屬離子、抗原與抗體等[81]。

3）融合標簽技術用于蛋白的純化

融合標簽技術用于重組蛋白質純化已為大量實驗所證實[82-86]。理論上，根據親和純化原理可定向設計使目標蛋白質與純化基質之間不發生任何直接相互作用的融合標簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質變性。目前已有許多不同的標簽可供利用。它們利用了標簽與固相配體間的相互作用，從而可從復雜的提取物中對標簽融合蛋白進行選擇性的結合和洗脫。目前常用的蛋白純化標簽是GST，His和表位標簽。

最常用的標簽是His標簽，即多聚組氨酸。該標簽由6～10個連續組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標簽與其他標簽相比有很多明顯優勢：①對金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力[87]；②與金屬離子的結合不受變性劑(尿素、胍)的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標簽的單抗或多抗也被應用于His融合蛋白的純化。

GST標簽是用來從細菌表達系統中純化蛋白較為成功的標簽之一。在該系統中，GST與被標記的蛋白進行融合，融合后的蛋白可在許多表達系統中表達。GST和谷胱甘肽緊密結合，融合蛋白可通過谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結合的蛋白后，結合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進行洗脫。該系統中被融合的目標蛋白?？烧_的折疊成為有功能的區域，故十分有用。該系統的另一個優勢是可快速、溫和地純化，且配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標簽(HA、c－myc和FLAG等)也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對表位標簽的單克隆抗體。為使標簽在純化中發揮良好的作用，在純化過程中應盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發生不可逆變性，目標蛋白的回收率低。用游離多肽競爭洗脫法洗脫結合在固相抗體上的標簽融合蛋白，是優選的方法。

4）融合標簽技術在其他領域的應用

融合標簽可提高重組蛋白的產量，由于外源蛋白質對于宿主菌的異質性，當外源蛋白質在宿主菌內表達時，宿主菌會調動各種機制來阻止外源蛋白質過量表達，導致的直接后果就是我們所需要的目標蛋白質表達量降低。近幾年的研究發現，當外源蛋白質融合某些特定的標簽后，能夠有效增加重組蛋白質的產量[88-90]。

融合標簽還可增強重組蛋白質的可溶性，外源蛋白質在宿主菌內表達時大多以包涵體形式存在[91]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導表達蛋白質，但這種方法并非對所有蛋白質都有效。研究發現，一些高度可溶的蛋白質在與其他蛋白質融合后會促進融合蛋白質以可溶形式表達，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金屬螯合親和層析技術

1）金屬螯合親和層析技術的發展

1948年，Hearon發現水溶液中組氨酸和半胱氨酸可與Cu2+，Zn2+形成穩定的復合物。研究還發現，固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Zn2+可與蛋白質表面裸露有咪唑基或巰基的氨基酸殘基結合。因此，含有金屬離子Cu2+或Zn2+的凝膠可用來選擇性吸附表面含有組氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白質。

1961年，Hellferich提出以固定于載體的金屬離子來分離小分子的概念，稱為配基交換層析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在瓊脂糖凝膠上偶聯了螯合配基亞氨基二乙酸(IDA)。IDA與金屬離子如Cu2+螯合后，可與蛋白質結合，不同組成的蛋白質與金屬離子結合力不同，據此將蛋白質進行分離。最常用的金屬離子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡態金屬離子。不同蛋白質分子內的組氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等殘基種類、數量、位置和空間構象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化。

1987年，Hochuli等[96]在目標蛋白質末端接上六聚組氨酸多肽得到純化的重組蛋白質。此后六個組氨酸標簽廣泛應用于重組蛋白質的純化。近年來，原核生物表達的重組蛋白質已有50%以上都是通過末端接有六聚組氨酸多肽而被純化出來[97]。

目前，固定化金屬螯合親和層析技術已成為蛋白質，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。

2）金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對蛋白質進行分離。金屬螯合親和介質與蛋白質的作用如圖2.1所示。過渡態金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點，在溶液中被水分子或陰離子占據。當蛋白質表面氨基酸殘基與金屬離子的結合力較強時，氨基酸殘基的供電原子(如組氨酸殘基的N原子、半胱氨酸殘基的S原子)將取代與金屬離子結合的水分子或陰離子，與金屬離子形成復合物，從而使蛋白質分子結合在固相介質表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸側鏈基團含有孤對電子的活性原子都能參與螯合反應，由于蛋白質表面這些氨基酸的種類、數量、位置和空間構象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化[98]。

圖2.1 金屬螯合親和介質與蛋白質的作用

生物分子與金屬離子間的結合強度與它們的軌道重疊程度有關，結合作用可分為三種[99-100]：

（1）靜電吸引：修飾后的基質帶有凈負電荷，它可吸附分離表面氨基酸殘基帶正電荷的蛋白質。

（2）配位鍵結合：蛋白質表面的組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等殘基上有咪唑基、吲哚基、巰基等，其氮原子、硫原子上未共用電子對與固定化金屬離子形成配位鍵。

（3）共價鍵結合：固定化金屬離子與蛋白質表面含硫基團作用形成共價鍵。

蛋白質與金屬離子親和力不同可用Pearson的軟硬酸堿理論來解釋[101]。該理論認為兩個原子相互作用成鍵時，其中一個原子作為路易斯酸，另一個作為路易斯堿。根據軟硬酸堿理論，金屬離子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+屬于硬酸；單價金屬離子如Ag+、Cu+歸類為軟酸；過渡態金屬離子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+屬于中間酸。相應的，與金屬離子結合的配基如氨基酸或蛋白質可分為三類堿，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基屬于硬堿；含硫原子(如半胱氨酸)的配基屬于軟堿；含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的配基屬于中間堿。中間酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可與含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的中間堿以及半胱氨酸結合。由于蛋白質表面裸露氨基酸中半胱氨酸極少，因此組氨酸殘基是與過渡態金屬離子結合的主要基團[102]。

六聚組氨酸融合蛋白在金屬螯合親和層析介質表面結合和解離流程如下：

（1）將螯合配基以共價結合的方式固定在固相載體上。

（2）加入含有金屬離子如Co2+、Ni2+的溶液，金屬離子會與螯合配基形成配位鍵而固定在固相載體上。

（3）加入含有六聚組氨酸融合蛋白的溶液或發酵液，使六聚組氨酸融合蛋白與金屬離子間以配位鍵方式結合在固相載體上，而與金屬離子沒有作用力的蛋白被分離出去。

（4）洗脫結合在固相載體上的六聚組氨酸融合蛋白。對金屬螯合親和層析介質上所結合的六聚組氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液進行洗脫，低pH可減弱蛋白和金屬離子的相互作用，使六聚組氨酸融合蛋白得以洗脫，而咪唑是競爭性取代劑，可置換結合在介質上的六聚組氨酸融合蛋白，較低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚組氨酸融合蛋白被洗脫[103]。

3）金屬離子的選擇

金屬離子的配位數直接影響其與螯合配基及生物分子的結合，配位數既要保證能與螯合配基形成穩定的化合物，又要保證有剩余的位點與目標蛋白的氨基酸殘基結合。由于金屬離子所帶電荷、離子半徑等不同，對蛋白質呈現不同親和力，目前常用金屬離子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它們具有相同電荷，離子半徑分別為69、72、74和74pm。半徑越小，配位作用越強，與蛋白質形成的絡合物越穩定。因此，Cu2+對蛋白質結合力最強，Ni2+次之，Co2+和Zn2+結合相對較弱[104]。

4）金屬螯合親和層析用于生物分離純化

篇（4）

作為上海世博會贊助商,上海和黃白貓有限公司(以下簡稱和黃白貓)將為世博會提供超過100種專業清潔產品和工具。在世博各場館、廁所、員工餐廳、社會餐廳、廚房,乃至世博局等公共區域都將使用和黃白貓的專業清潔用品和服務。

和黃白貓是由和記黃埔有限公司控股子公司與上海白貓(集團)有限公司于2006年3月共同組建的中外合資企業。公司前身可追溯到1948年成立的上海永新化學工業股份有限公司。該公司創立的“白貓”品牌,自1963年起已有近半個世紀的輝煌歷史,在中國深入千家萬戶。

白貓清潔世博

記者在采訪中了解到,和黃白貓在世博會項目贊助商名單上脫穎而出,完全體現了優勢互補與互惠互利。

從2008年上半年和黃白貓就開始和世博局進行贊助事宜接觸,應該算是日化行業里比較早的一家。

上海世博會“城市,讓生活更美好”的主題與和黃白貓的品牌宗旨和核心價值――“干凈到家了”完全吻合,這也成為了合作雙方談判與合作的基礎。

和黃白貓董事長杜志強在接受《小康•財智》記者采訪時說,“白貓”作為中國本土著名品牌、中華老字號,在全國特別是華東及上海可謂家喻戶曉?！案匾氖?和黃白貓擁有民用清潔產品和專業清潔產品兩個事業部,可以配套為世博會提供完整的產品與相關服務。這也是我們能服務世博會的最大優勢。”

杜志強稱,世博會期間預計有超過7000萬人次的參觀者,這一數字是2005年日本愛知世博會的近3倍、2008年北京奧運會的10倍。如此大的人流量對世博園區的公共衛生安全工作是一個極大的挑戰,其中,世博各場館、廁所、廚房等公共區域的清潔消毒衛生工作尤為重要。

他介紹,為了配合世博會對于公共區域衛生安全的要求,和黃白貓的專業用品事業部專門設計與開發了一系列清潔產品、清潔工具以及與之配套的培訓、服務系統。

世博衍生價值無限

作為上海世博會贊助商,和黃白貓為上海世博會提供現金以及產品與服務的贊助。

杜志強稱,受贊助協議保密條款的限制,不便透露現金以及產品與服務的具體價值。“不過,我們更看重產品與服務這塊,因為它將直接服務于上海世博園區和參觀者。與現金贊助相比,它的衍生價值是無限的?！?/p>

篇（5）

我傷心地趴在地上，嚎啕大哭。周圍的人們卻用奇怪的眼神看著我，然后鄙視地說：“這么小就發春了……”我聽不懂意思，然后無奈地磨爪子，摸摸自己可愛的小絨毛和小肉墊，然后發誓今天晚上我很傷心，決心只吃一條魚。我聽見過其他野貓叫的聲音，還問過一只老貓，她喵嗚喵嗚地告訴我，野貓半夜貓叫一般都在發春，我眨眨眼睛問她什么是發春。她搖搖頭深沉地告訴我，小孩子懂這么多要干么。然后很善良地還教我發出喵嗚喵嗚拉長的聲音，她說這個貓叫聲聽起來比較嫵媚，以后我擇偶的時候，提供給我選擇的公貓會比較多。我感激地讓她摸了摸我的粉紅小肉墊。

晚上我真的只吃了一條魚。從垃圾桶撿來的，味道很惡心。可是那只老貓告訴我，貓都喜歡魚的。我是貓，當然喜歡魚，于是我咽了下去。我做了個夢，夢到有一只善良的母貓還有一只猥瑣的不明生物。不明生物對母貓不知說了什么，母貓驚叫不要。她滿臉是淚，我見尤憐。我同情心泛濫，卻不知道怎么安慰母貓。

然后一覺醒來我發現我換了新地方。不是那個舒服的紙皮堆，而是干干凈凈的毛毯。我一滾，毛毯就變色了。變得黑黑的臟臟的，上面還有我的爪子印。我默哀著毛毯，一邊打量自己所在的地方。是屋子，有家具，有吃的。打量完畢。

另一間屋子的門突然開了，嘎吱的聲音讓我覺得很悅耳。然后我抬頭以45°明媚而憂傷的姿勢仰望。是一個人類。有頭發有眼睛，還有嘴巴鼻子和耳朵。然后是雄性。

雄性人類似乎驚訝于我的蘇醒，然后不管不顧地撲上來呼喚我羞羞……我震驚而憤怒，我做為一個雌性貓咪，絕對不能讓一個雄性人類破壞了我的和清白！我爪子抓過去，然后憤怒地要撕咬。結果雄性人類卻猥瑣地摸了摸我引以為傲的粉色小肉墊傻乎乎地笑了。

這件事情過去一年多了，我也不再是年幼無知的小野貓了。我成了這位雄性人類口中的寵物，名字叫做羞羞。據說我是他口中從天而降的莫名其妙的寶貝。他讓我喚他主人，我扭捏地給他一爪子。因為他不僅是個猥瑣的變態，還好面子，勒令我不準在他房間撒尿。

現在我是一只小家貓，我有名字，我叫羞羞。

二

老大！怎么辦??！裊裊跟著那個人類住在一起了！一只哭泣的水獺以明媚而憂傷45°仰望高高在上，實際比自己矮的一只狐貍。

，我們不會去搶回來??！王上只規定我們把裊裊帶回來，其他的什么都沒規定，怕什么。天塌下來，有例如我這樣高的狐貍頂著。

水獺的內心淚水在洶涌。明明我一直比你高的……

二人組制訂了完美的計劃。名字很好很動聽，叫做裊裊的浪子回歸路。

請原諒這兩只動物的用詞不當，畢竟這是這兩只動物商量一晚上否決一晚上得出的理論。

第一步。裊裊出現了，好白好亮的皮毛啊！狐貍羨慕地望向那只白色的貓，然后變身狐貍犬的他被旁邊偽裝成老鼠的樹獺揪著辦正事。老大老大，那個雄性人類要上班了，裊裊現在一個人在家，我們去搶吧！

狐貍淡定了，高傲地對書獺說。你進攻，我幫你四處看著。樹獺內心更有淚水奔騰。不帶這么欺負樹獺的啊。樹獺不情不愿地顫抖著走到貓的面前。你好……嗨……

白貓無視了這只奇怪的老鼠，思索著今天好像沒有摸自己的小肉墊。

樹獺的膽子大了起來，然后慢慢捂住白貓的眼睛，大叫著。狐貍老大快來幫忙??！

白貓一爪推開這只找死的老鼠，繼續思索這個偉大的問題。

引誘裊裊的回歸路。宣告毀滅。

第二步。很好，裊裊又出現了。

樹獺舉著一條自己很舍不得的魚隆重做了告別儀式，狐貍又氣又急，然后在一旁安慰自己他笨他腦子有問題……樹獺舉著這條魚，從陽臺上悄悄進入白貓所在的屋子。安穩入睡的白貓翻了個身，繼續睡。樹獺堅持不懈地把魚高舉于白貓的眼前。

白貓翻了個身，還是睡。其實無論怎么翻，她仍然是趴著的。

內心激浪的樹獺仰天淚流。狐貍老大，裊裊的浪子回歸路，任重道遠啊……

第三步。決心自己出手的狐貍相信自己一定能使裊裊重新回到他們身邊的。他趁著裊裊在大街上閑逛的時候，攔住了她。然后飛撲著流淚……裊裊，我是狐貍叔叔啊……

白貓羞羞覺得自己今天遇到了兩只神經病。狐貍哭訴著自己這幾年過得不好，王上虐待，沒有裊裊在身邊寂寞難耐……羞羞無語地望天。 狐貍終于說出了一句正常嚴肅的話。羞羞，跟我走，大家都找?煤鎂昧恕

茫然的羞羞抖了抖耳朵。狐貍嚴肅地對著茫然的白貓教育道。你是王上的三姑媽的六阿姨的四妹妹生的女兒，由于王上的三姑媽的六阿姨的四妹妹生你時跑出了生命森林，最后把你生在了人類世界，卻和你失散了……裊裊，你媽媽很想你。

白貓羞羞石化了。沒想到自己還有個媽媽？！而且自己根本不是人類世界的普通貓？！太驚悚了，比和雄性人類看所謂鬼片還驚悚！ 無法接受現實的白貓羞羞可恥地暈過去了……

三

白貓羞羞知道這次醒來一定在不同的地方。

是洞穴。

一只善良的白貓淚奔著朝自己飛撲而來。不用說，這是夢中的善良白貓，也是狐貍口中的媽媽了。被媽媽緊抱著的羞羞感到一種從未有過的幸福。很滿足，比吃了雄性人類給自己的貓飼料還滿足。

洞穴外漸漸有個黑點朝著自己走來。羞羞抬起頭，卻看到一匹純白的似馬非馬的物種。善良白貓熱情地介紹物種。這是馬貓，是王上，至于輩分……怎么也想不出怎么讓裊裊稱呼馬貓的貓媽糾結著。

羞羞看著馬貓，眨巴著貓眼善良地問了一句。難道你真是馬和貓生出來的？羞澀的馬貓不好意思地承認了。

被雷得風中凌亂的羞羞仰天無語。

生命森林的動物很奇特。生命森林的動物很人類化。生命森林的動物很好相處。

善良的貓媽，猥瑣的狐貍和樹獺，以及奇怪物種馬貓。從這一天起，羞羞正式改名為裊裊。

裊裊卻時常很憂傷，她想起雄性人類的家，想起那群人類世界的野貓，想起雄性人類的溫柔，想起他的忍讓。裊裊嘆了口氣。難道自己還不知足么？

善解人意的貓媽讓裊裊最后一次回去人類世界。裊裊回到了她和雄性人類住的屋子。很干凈，地上還殘留著她的貓毛?？墒沁@個時候，雄性人類不是下班了么？她看到桌上有一疊紙，寫著鳥語，不懂。卻看到有照片，照片上驕傲的白貓不屑地望著鏡頭。

裊裊的眼角有透明液體。她自我安慰：貓是不輕易流淚的。

雄性人類回到了家，他看到裊裊激動地撲上出，淚如泉涌。羞羞，羞羞……我以為你走了……再也不回來了……

不喜歡矯情的羞羞一爪子拍開他，眼角卻有透明的液體。

裊裊回到了這件屋子?；氐搅巳祟愂澜?。

她還是羞羞，不是裊裊。

生命森林的動物們制定了很多的裊裊的浪子回歸路計劃。連貓媽都出動了。

羞羞不為所動依然淡定地在人類世界當一條普通的白貓。

篇（6）

比如李嘉誠在內地保健品領域，就擁有不小的話語權。

羊胎素、有機奶粉、專供孕婦食用的 DHA產品，以及某些內地學生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉誠的產業。準確地說，這些產業都歸攏在和記黃埔旗下的和黃健寶保健品有限公司，這家公司成立已超過10年。

求醫問藥時，有些常用藥，比如板藍根顆粒、復方丹參片，也有李嘉誠的影子。

和記黃埔旗下有專門的醫藥科技公司，在醫藥行業是不折不扣的“隱形大戶”，勢力覆蓋“北上廣”李嘉誠在北京與同仁堂合作，在上海開辦有上海和黃醫藥有限公司，在廣州與白云山醫藥合資建廠。

2004年時，李嘉誠明確定調：中藥將是和記黃埔的第六大支柱產業。緊跟著在2006年，李嘉誠就將他的醫藥公司名單，掛上了歐洲的倫敦交易所，成了筆跨國大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉誠在公司股東會后出席新聞會。

另外一個巨頭雀巢公司就看中了李嘉誠在中藥產業上的判斷，更看中李嘉誠在中藥行業隱秘深耕多年的家底：和記黃埔的中藥材庫十分巨大，包括1200多種藥用植物的5萬種提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中藥產業在此之前，這家瑞士公司也確實在嘗試做一些實驗，比如在嬰兒米粉中加入綠豆和蓮子，讓產品能“去火”。

雀巢現在與李嘉誠合伙開辦了一家公司，希望可以找到用中藥治療腸胃病的辦法。

總之，熱衷于進入醫藥行業，這一點李嘉誠與比爾·蓋茨的投資興趣很像。

除此之外，一個日化品牌白貓洗潔精，從2006年開始，就已經是李嘉誠的無形資產。2006年和記黃埔收購了白貓集團所持有的上海白貓有限公司80%的股份，共同組建上海和黃白貓有限公司，也就是“和黃白貓”。2009年4月，白貓集團又將“白貓”商標轉給和黃白貓，所以在市場上看到的“白貓”洗滌產品，已經蓋上了李嘉誠的烙印。

需要說明的是，“白貓”其實有兩個，另一個“白貓”是白貓股份，是一家經營不善的上市公司，2010年已退市。其間兩只“白貓”烏龍不斷，引得和記黃埔的新聞發言人要不時澄清：這只白貓和李嘉誠沒關系。

李嘉誠在另一個時髦領域互聯網、IT行業的投資令人感覺距離感更小。

他投過facebook、skype，以及后來被蘋果公司買走的語音助手軟件Siri。投facebook的決策時間只花了五分鐘，而當時的facebook尚未營收。五年間，他手中所持的3%股權，回報率高達580%，據估計，他能從中賺得20多億美元。李嘉誠卻表示，在自己投資的新科技公司中，facebook賺得未必最多。

為他物色高科技企業的公司叫維港投資，專注于中早期科技類項目其操盤者正是五分鐘內說服李投facebook的周凱旋。據《經濟觀察報》報道，維港投資團隊成員只有四名，一貫低調，沒有官方網站，卻能憑其遍布全球的團隊，挖掘出一般人不易察覺的項目。

再往近了說，我們的“衣食住行”，也有“李嘉誠牌?！比A南地區能吃到的東北大米，會有一部分來自和記黃埔在黑龍江的生產基地?！蹲C券時報》曾經報道說，在中國入世前，李嘉誠受邀到黑龍江投資稻米，并于1998年成立合資企業，開發近150萬平方公里產糧地。

篇（7）

2歲以前

女兒出生后幾天，從廣州天河區婦產醫院回家時，在家里歡迎她的就有一條司愛的長毛小狗花花。花花頗有靈性，很快就明自了小寶寶在我們家中的地位，從來也不敢去碰一下孩子，只是不近不遠地守著，而且非常盡職。女兒三四個月大的時候，似乎不會哭，她醒來時，沒什么聲響，我們不在房間，自然就感覺不到女兒醒來。這時，花花就會來扯我們的褲腿或鞋子，引我們去孩子的房間。女兒非常喜愛花花，只是后來給女兒看病的醫生數落我們不注意衛生，我們才把花花關到了陽臺上。可女兒還是每天要去陽臺看一看花花，有時還要連去幾次。

女兒1周歲，我們到了重慶，住在郊區農村的外婆家，又有了養狗的條件。一天，有個狗販子牽著幾條土狗到我們屋前，并介紹其中的一條特別兇，我卻偏要去摸一下那條狗。奇怪的是，它對我顯得特別溫順?？词怯芯?，我就把它留下了。這是我專門買給我女兒的第一條狗。狗販子叫它“小狗”，我們也叫它“小狗”。它礁實很兇，盡管有鐵鏈鎖著，也經常要；中出去咬人。

女兒卻對它寵愛有加。所有，的好東西，都要拿去喂它。吃飯一定要和“小狗”分享，就連她拉出的屎也要留給它吃。平常女兒愛摸摸狗的耳朵、揪揪它的尾巴，后來還要騎到它的背上，那小狗總是俯首聽命的樣子，挨著小主人。但它對陌生的路人，仍然是那么兇。有一回，一個路人經過，我女兒命令它：“沖，”它真的吼著沖了出去，雖有鏈子拴著，也著實把路人嚇了一跳。后來我才明白：它那么兇，是因為它已懷有仔仔，懷仔的母狗是要比平時更兇一些。不久，“小狗”就生了兩個仔仔公的叫阿旺，母的叫阿彩，這可把我女兒樂壞了。她經常提著、抱著兩只小狗，有時還抱到我們睡覺的床上去，屢禁不止?？粗龑π游锏哪欠N深愛，我時常不顧妻子的反對，網開一面，由著她在床上同小狗嬉戲。孩子與小動物一起玩，能自然地表現她內心的愛，也能通過與動物的接觸，了解動物。動物世界恐怕是幼兒對外界感知最樂意探究的一個世界了。

除了“小狗”，我還先后給女兒買了一只白貓和一只花描。那只白貓看起來就挺可愛，只是冬天老要跳到我們床上來睡覺。揮之不去，簡直無奈它何。而且，不見它捉老鼠；捉老鼠的事情是由“小狗”代庖的?？墒俏遗畠簠s非常喜歡它。后來，那只白貓出去就再也沒有回來。我女兒很傷心，在給幾十公里外的我打電話時，首先告訴我的就是白貓的事。為了安撫女兒，我又買回一只花描?？墒遣痪茫ㄘ堈`食老鼠藥而死了。我女兒又不免傷心一陣。后來，我們一家三口搬到重慶市里去住，就無法養狗養貓了。但是，我們會天天帶女兒去重慶的市府廣場，吃過晚飯后，那里有很多出來溜狗的，各種各樣的狗，應有盡有?？吹矫織l拘，女兒都要去逗逗。而且，廣場的一角還養著一群鴿子，女兒非常喜愛在那里喂鴿了。

2歲隊后

從重慶經上海再到浙江的海鹽后，我們又有了養小動物的空間。最多的時候，我家有一只小狗、一只小貓和各種鳥(十幾只)，一大堆小動物，非常熱鬧。這時候，女兒玩著動物已學會了不少有關動物的英語單詞 和短句子。漸漸地，女兒對貓咪情有獨鐘。

女兒自號Sister Cat，模仿貓的動作、神態，每天要督促我們別忘了給貓咪買小魚。最有趣的是，女兒看了一部描寫外國科學家飼養動物，并進行研究的片子，看到他們用英語與動物溝通，她就認為動物能聽懂英語，而聽不懂中文。所以，她時常會與她可愛的貓咪說一大堆英語。她還給這只貓咪起了個英語名字：Angel(天使)。我問她為什么起這個名字?她說：“我的名字是Angella，我是她姐姐，我的妹妹就應該叫Angel。”聽起來還頗有道理。

對小動物的喜愛，也帶動了女兒的學習。比如全神貫注地觀看有關動物的動畫片；學畫動物；不厭其煩地反復學習有關動物的中外文字，她第一個脫口而出的日語就是neko(貓)！乃至教她的《詠蛙》詩，她也學得津津有味，讀幾遍即能成誦。更沒想到，過一些天，女兒還根據的《詠蛙》，改出了她的《詠貓》詩。

《詠蛙》

／1909年

獨坐池塘如虎踞，

綠蔭樹下養精神。

春來我不先開口，

哪個蟲兒敢作聲?

《詠貓》

女兒的改作／2004年12月

獨坐客廳如虎踞，

桌子底下養精神。

篇（8）

話劇開始了，出現了獨眼狼、單眼狼，他們被關進大牢里，外面有很多士兵守衛。就在這個時候，臭狐貍代表大灰狼來看他們。它手里拿著一盒曲奇餅干，說：“我特意代表大灰狼來看你們了，這盒餅干是我們的一點心意。當年大灰狼和你們一起坐牢，可是被一場海嘯分開了，這次我們找到了你們，特意送來餅干，表示一點心意……”

狐貍走了，衛兵也走了。獨眼狼和單眼狼食偷偷地把曲奇餅干盒打開，他們發現盒子里面有一個紙條和一把萬能鑰匙，他們說：“這一定是大狼給我們的。”然后他們說，這兩天一定會來一場大大的雷陣雨，所以要它們趁雷陣雨和霧氣很大時把門偷偷打開，逃出去。

當然，這個計劃成功了。半路上，突然聽到黑貓警長的聲音，他們拼命的逃，逃到了一家超市店門口，因為今天有雷雨，超市提前關門。他們突然想起自己手中有一把萬能鑰匙，他們就用萬能鑰匙把門打開，進入超市偷走了很多東西，把肚子也填飽飽的了。

可當出來的時候，發現黑貓警長把他們包圍了。這時，大狼和狐貍從四周殺來救他們，于時他們沖出了包圍。壞蛋們一起逃啊逃啊，突然發現黑貓警長在前面攔住了他們，白貓警長和小鹿警官在后面攔住了他們，使他們無路可逃，又被關進了大牢。

篇（9）

這三節課的共同點是：

一、基本上都落實了學講計劃的精神，先學后教，給足了學生自主學習的時間，整個教學過程中滲透了學生的自學、互學，教學的痕跡。突出了學生的主體地位，教師退到了后面，給足了學生充分展示自己的機會，教師主要發揮四兩撥千斤的作用。

二、課堂教學有重點突出，教師對于教材的解讀深刻，有新意，教學程序設計巧妙，環環相扣，條理清晰。教學過程中，重視對學生的朗讀訓練，形式多樣，教師指導到位。

三、教師教態自然大方，在上課前都注重課堂管理，采用交談，夸贊、鼓勵性的話語拉近與學生的距離，讓學生入情入境，充分調動學生的學習積極性，課堂氣氛活躍。在教學過程中，教師語言親切柔和，對學生的表現，評價及時中肯。

這三節課體現了三種不同的風格：

第一節宋穎老師執教的《桂花雨》，就如宋老師給人的春風化雨般的感覺一樣，溫柔舒適，親切柔和，真有如沐春風般的感覺。尤其是指導朗讀很有特色，善于創設情景讓學生入情入境。在指導朗讀贊美桂花之香時，創設了四種情景讓學生讀，當桂花落在額頭、鼻尖、衣袖、全身不同的情況下對桂花的贊美。再如理解"纏"時，又創設了一天之內的不同時間"纏"著媽媽問啥時搖桂花的情景，讓學生朗讀體會。最動情的地方是配樂朗讀和電影般的情景再現似回讀。宋老師選的配樂曲溫婉動聽，聽了確實令人動情，加之宋老師高超的朗誦水平，確實讓學生直接的感受到了懷念故鄉之情。宋老師還聯系了最后一句中懷念兒時搖桂花的情景，運用配樂的方式回讀文章的第三節搖桂花的句子，再現了這一情景，真如電影回放一樣，聽這節課令人很感動。

篇（10）

小編大話:不由聯想起大話西游的孫悟空面對紫霞時,動心則傷身,世間最痛苦之事莫過于此。

最聰明白貓:不愛吃魚專吃草

一只大白貓先是撥弄著一堆枯草,從枯草中尋找起青草的根部來。過了老大一會后,它把頭伸進枯草里聞,在草堆里咬起其中的幾根嫩青草來,并津津有味地嚼起來。然而,令人意想不到的是,過了一會兒,在吃了多根青草后,這只小貓突然竄至路邊一小轎車旁,在一處隱蔽的地方嘔吐了起來,隨后,它聰明地用爪子扒起土塊,把嘔吐物蓋上才離開現場。

貓的主人朱先生稱,小白貓名叫小白,至今年也才養了兩年時間。平時它喜愛吃魚,還有一些其它的肉食,有時喂蘋果給它吃,但它聞都不聞。有時碰到素食,是寧可餓肚子也不吃,十分地倔強,還會“喵喵”地大叫,以示抗議。最近幾天,朱先生才發現小白對青草如此好奇,有時還品嘗。也是偶然之間,他發現貓有嘔吐現象。

寵物專家稱,可能這只白貓患了胃病,通過吃草來治療。據其介紹,動物有一種天性,就像人類生了病,也能找到某種草藥可以治愈一樣。比如,當白貓的肚里有寄生蟲或是患上消化道疾病時,往往就會發生胡亂吞草的情形,以此來達到催吐之效,從而把令其身體不適的東西吐出來。

小編大話:貓中“神農”驚現世間,不靠獸醫能自診。

最星范兒動物:修煉成精的牧羊犬

現年10歲的英格蘭牧羊犬“藍色”自從6個月時便跟隨主人模仿臺球動作,如今竟無師自通地學會了打臺球。由于球技高超,他已經成了遠近聞名的“臺球神犬”。“藍色”是一條博德牧羊犬,它的主人介紹,“藍色”對臺球懷有天然的興趣。每當主人在酒吧舉桿打球時,“藍色”便會聚精會神地在一旁觀察。隨著個頭的長大,“藍色”無師自通地學會了打臺球。它總是用兩條后腿站立,抬起兩條前腿伏在球案邊上認真瞄準,最后用前爪猛地撞擊一下主人事先為它架好的球桿。每當彩球應聲落袋,“藍色”都會興奮地圍著球桌跑幾圈。

小編大話:如今寵物們可不甘心單調的生活,他們也能大膽秀自己。

最佳和平獎:海豚與老虎惺惺相惜見面吐泡泡問好

在自然界,海豚和老虎幾乎難以相遇。不過,在美國加利福尼亞六旗探索王國游樂園,一只寬吻海豚(bottlenose)竟然和一只孟加拉老虎結為了好友,在相見"小虎妹" 時還會以吐泡泡的獨特方式問好。

這只名叫馬利克的寬吻海豚似乎對孟加拉虎崽阿卡薩心存好感。每當這只孟加拉幼虎靠近玻璃水缸時,海豚馬利克便會主動翹起頭游到它跟前,并還會轉過身子讓它慢慢欣賞。

據了解,孟加拉雌性幼虎阿卡薩只有6個月大,而馬利克則已有1年2個月大。據六旗探索王國游樂園(Six Flags Discovery Kingdom)的工作人員透露,"小虎妹"阿卡薩是在被飼養員帶領散步時結識到了這位海豚好友。

小編大話:21世紀什么最重要?和諧嘛!

最怕冷少年:體溫僅30℃

英國柴郡沃林頓市的14歲男孩本?布朗患有一種罕見的“下丘腦綜合征”,這一怪病導致他的身體體溫總是比常人的正常體溫低7℃。只有30℃體溫的他成了世界上“最怕冷的少年”,即使在烈日炎炎的大熱天里,他也必須穿著厚厚的冬裝,戴著羊毛帽,圍著羊毛圍巾,把自己裹得嚴嚴實實。稍不注意,他隨時都可能陷入昏迷,引發生命危險。

布朗笑著說:“我的朋友們也希望體驗一下我的疾病―――僅僅體驗一次。不過老實說,我的疾病非常讓人煩惱,我必須萬分小心。如果我感到體溫下降,我必須立即躺進浴缸中洗熱水澡,并立即將自己裹得密不透風。不過,你不應該讓這種事影響你的生活,你必須在生活中保持微笑。”

小編大話:小本?布朗應該搬到蘇丹去,那是最適合他的地方。

最長的舌頭:美長舌男用舌頭舔眼睛發短信

美國加州20歲男孩尼克?阿法納西耶夫號稱擁有全美最長的舌頭,他可以輕松地用舌頭舔到自己的眼睛,還能用舌頭來發短信,相當神奇。

靠著自己的這項特長,尼克上遍所有的電視節目做宣傳。在一次直播中,女主播忍不住好奇,用尺子對尼克的舌頭進行了測量。測量結果顯示,舌頭長9厘米,接近世界紀錄了。

尼克的另一項絕活是用舌頭發短信,他用舌頭在手機上寫字,然后熟練地發出一條信息。他開玩笑說:“開車手沒空時,舌頭就可以發短信。”

目前,他靠著長舌拍了50多部影片,《變形金剛3》劇組也邀請他演出。

小編大話:但愿他的舌頭不要再生長了,否則他的嘴巴容不下,將來不得不像獵犬一樣將舌頭從嘴巴中耷拉出來。

最震撼的服務:超級接客時地動山搖

日前,德國一名被鄰居告上法庭。原因不是非法,而是她接客時動靜太大,常常讓鄰居們感覺“地動山搖”。

這位名叫伊爾內斯?洛爾巴赫,體重竟達230斤。她的鄰居卡洛爾索?霍夫曼抱怨稱:“我感覺就像身處電影《大地震》中的情景。不知道是不是她或者她的客人讓大地都震了起來,但我們確實感覺到震動?！辈贿^,洛爾巴赫也有讓人同情的一面――她是一位單身母親。目前,她正計劃讓自己的“工作”合法化,希望能在德國拿到許可,然后用自己的房子開一家小型妓院。

洛爾巴赫的鄰居霍夫曼在接受《太陽報》的采訪時說:“每當她接客的時候,我家里書架上的水晶飾品就會掉下來,墻上的畫也會散落得到處都是。與此同時,洛爾巴赫也對鄰居們充滿歉意。上周,由于她的“過失”,鄰居家的一對名貴的杯子被打壞。據稱,每個杯子都價值100英鎊。

36歲的洛爾巴赫在接受采訪時說:“一個單身母親靠這種方式糊口確實很難,但我努力讓自己變得勤勞,讓不可能變成可能。”目前,距離法庭的宣判還有一段時間,同樣身為女性的法官尚未決定該如何判決。

小編大話:還是勤勞致富吧!

最潮新品:解放鞋大變身受追捧

你家還有老底子的解放鞋嗎?有的話,趕緊擦擦灰,穿起來。如今,日本最新潮品就是解放鞋,而且改良版的解放鞋在歐美成時尚寵兒,身價堪比耐克。

千萬別詫異,這種早就被國人遺棄的布鞋,搖身一變已成了時尚新寵兒。在美國,一雙改良過的解放鞋甚至賣到了65美元,跟國際知名品牌NIKE同等價位?！本W友們的議論也很熱烈:有的說下次出國要批發一堆解放鞋帶出去;還有的說,如果我手挽一只LV的編絲袋、腳蹬一雙綠色解放鞋,那我就是最時尚的人了!

小編大話:中國元素越來越多的展現在世界面前,被時尚人士追捧。

最捉弄人的軟件:“測出你有多丑” 隨機送毒舌評語

當一款軟件智能到可以評論一個人的長相時,人們就會大呼過癮了,但當它還隨機附送毒舌評語時,被評丑的人就不得不捶胸頓足了。

據悉,一款在iPhone上使用的名為“丑臉評分表”(UglyMeter)的應用程序面世,聲稱可以“測出你有多丑”。只要拿著iPhone對著人臉或照片進行拍攝,這款軟件就會實時分析照片中人的面部輪廓,并給出一個分數,分數越高,說明長相越“丑”,其中最高分為10分。最有趣的是,這款軟件還能隨機給出毒舌評語,令人捧腹。

有好事者用“丑臉評分表”給幾位家喻戶曉的“明星臉”打分。中國臺灣名模林志玲最討此軟件歡心。林志玲被評為1.2分級的超級美女。緊隨其后的好萊塢影星安吉麗娜?朱莉得分只有2分,如此低的分數說明“美女是經得起各種考驗的”。

小編大話:這可是最整蠱人的玩意了,即使機器和人類的審美觀有差異,但機器是不會撒謊的。