保護眼睛的途徑匯總十篇

序論：好文章的創作是一個不斷探索和完善的過程，我們為您推薦十篇保護眼睛的途徑范例，希望它們能助您一臂之力，提升您的閱讀品質，帶來更深刻的閱讀感受。

篇（1）

[中圖分類號]G64[文獻標識碼]A[文章編號]1005-6432（2014）43-0163-02

1加強頂崗實習權益保護的意義

根據國務院《關于大力發展職業教育的決定》和教育部《關于全面提高高等職業教育教學質量的若干意見》的精神，要大力推行工學結合，突出實踐能力培養，通過工學交替、頂崗實習、訂單培養等人才培養模式來實現教學過程的實踐性、開放性和職業性。因此，頂崗實習是行業、企業、學校優勢互補和資源共享的客觀要求，是實現教學過程與生產過程對接的需要。

頂崗實習是《國務院關于大力發展職業教育的決定》中的“2+1”教育模式，即學生在校學習時間為2年左右，最后1年在實習指導教師或企業師傅的具體指導和組織下，學生以技術、生產、服務或管理人員身份在特定的工作崗位上帶薪生產。其包含兩層含義：頂崗，即履行崗位的任務與職責，其勞動付出等同于企業工作者；實習，是指學生在實習單位通過實踐學習專業技能。因此，頂崗實習的學生具有“學生”與“勞動者”雙重身份。在實習工作中，他們承擔了企業員工的任務與職責，但由于學生這層身份，并不受《勞動法》保護，而目前國家也沒有專門的法律法規來保障高職院校學生實習期間的合法權益，更沒有具體涉及學生在企業實習活動中的勞動保護、事故處理等問題的對策。高職院校學生頂崗實習權益能否得到有效保護，事關家庭、社會的和諧穩定，事關學校的持續健康發展。

2頂崗實習期間權益風險分析

21在危險環境中工作，生命安全受到威脅

頂崗實習學生雖是代替企業職工進行作業，但并不受《勞動法》保護。如果企業與學生均安全意識不強，且實習企業中確實存在容易造成安全危險的生產環境和設備，則進行頂崗實習的學生就很容易面臨各種安全事故的威脅，而且缺乏法律保障，將面臨無法依法獲得救濟的風險。

因此，為了保障實習學生的安全，維護學生頂崗權益，2007年教育部與財政部聯合頒布了職教成4號文件《中等職業學校學生實習管理辦法》，首次對實習學生提出“五個不準”：不準安排一年級學生到企業等單位頂崗實習；不準安排學生從事高空、井下、放射性、高毒、易燃易爆、國家規定的第四級體力勞動強度以及其他具有安全隱患的實習勞動；不準安排學生到酒吧、夜總會、歌廳、洗浴中心等營業性娛樂場所實習；不準安排學生每天頂崗實習超過8小時；不準通過中介機構組織、安排和管理實習工作。

22企業競爭激烈，休息時間被剝奪

隨著經濟的發展，企業競爭日趨激烈，企業為了生存發展，不得不使出渾身解數爭奪市場，搶占商機。為了滿足市場需求，各崗位工作量增加，導致企業隨意安排加班勞動。《勞動法》規定一般加班時間每日不得超過1小時，特殊原因情況下每日不得超過3小時，且每月不得超過36小時?！吨械嚷殬I學校學生實習管理辦法》第五條明確規定，“不準安排學生每天頂崗實習超過8小時”。

23受學生身份限制，未能獲得相應的勞動報酬

由于頂崗實習學生未能與企業簽訂就業合同，未明確勞動報酬，某些企業視學生為廉價勞動力，與其他勞動者不能同工同酬，甚至基本月收入遠遠低于當地最低生活保障工資等現象都在一定程度存在。《職業教育法》規定，“企業、事業組織應當給予上崗實習學生適當的勞動報酬”；《中等職業學校學生實習管理辦法》第八條規定，“實習單位應向實習學生支付合理的實習報酬。學校和實習單位不得扣發或拖欠學生的實習報酬。”

24未能享受等同于企業員工的勞動保護及工傷保險權

由于頂崗實習學生的雙重身份，仍為在校學生，不能簽署就業合同，不受《勞動法》保護，某些企業在學生發生工傷后拒絕賠償。《中等職業學校學生實習管理辦法》第十二條規定“要為實習學生購買意外傷害保險等相關保險，具體事宜由學校和實習單位協商辦理。實習期間學生人身傷害事故的賠償，依據《學生傷害事故處理辦法》和有關法律法規處理?！?/p>

3頂崗實習期間權益受侵害的原因

31缺乏專門的頂崗實習權益保障的法律制度，學生無法可依目前我國沒有一部專門針對高職學生在頂崗實習期間權益保障方面的法律法規。我國《教育法》、《勞動法》、《勞動合同法》、《高等教育法》均沒有規定任何頂崗實習內容。唯一一部涉及頂崗實習的國家法律《職業教育法》僅提到“國務院有關部門、縣級以上地方各級人民政府以及舉辦職業學校、職業培訓機構的組織、公民個人，應當加強職業教育生產實習基地的建設，企業、事業組織應當接納職業學校和職業培訓機構的學生和教師實習；對上崗實習的，應當給予適當的勞動報酬”，內容簡略，操作性不強。

32企業、學校、學生簽署的實習協議中，職責不明

在生產實習中，未明確劃分企業、學校、學生應盡的權利、義務與責任。由于頂崗實習學生的雙重身份，決定了在實習過程中應由學校、企業雙方共同管理。如若學校和企業雙方對權利與義務不明確，雙方管理重合，會造成管理主體混亂；雙方考慮若有空缺、漏項，則可能帶來實習工作中的安全隱患。

33學生缺乏法律意識，自我維權意識不強

某調研機構針對高職院校學生頂崗實習權益保護等問題展開問卷調查，調查發現有半數以上的學生對法律賦予自己的權益知之甚少，僅有8%的學生知道《勞動法》規定每周勞動時間為40小時；有363%的學生會在自己的合法權益受到侵害時選擇“離開”或“忍讓”，他們認為維權的成本過高，不值得。有821%的學生每天工作時間超過8小時，476%的學生一個月中沒有休息日，其中沒有按規定支付工資的占總人數的395%。

4高職學生頂崗實習期間權益保護方法

41盡快建立專門的頂崗實習權益保障的法律制度

無法可依是目前高職院校學生頂崗實習期間維護自身權益的最大障礙。要建立專門的法律，通過國家強制性手段來規定企業與學校的責任，以保障頂崗實習學生的人身權、休息權、報酬權、勞動保護權、工傷保險權等合法權益不受侵害。

42學校方提前對實習企業進行危險源評估

在學生實習前，學校應提前去企業考察，對企業中較為危險的環境與設備進行危險評估，與企業協商將危險隱患盡量降低以達到可接受程度并拿出應對策略，或放棄該實習工作。

43與企業簽訂詳細的實習協議，明確各方的權利、義務和責任目前，由于我國法律對頂崗實習權益保護的缺失，通過簽署學校、企業、學生三方協議，來規范各方的權利、義務與責任。一旦發生勞務糾紛或工傷、安全等問題，可根據協議劃分責任，采取民事訴訟來保護自己的相關權益。

44加強法制宣傳，提高學生的維權意識

法律知識貧乏是維權意識淡薄的主要因素。學校需加強法制教育，開展法制活動，使學生在生活中接觸到法律，鼓勵其用法律解決問題，維護自身的合法權益。

45加強維權力量，建立校內維權機構

建立專門的維權部門，既可對校內學生宣傳法律知識，加強其維權意識；又能對權益受到侵害的學生提供咨詢服務；還能站在學校的立場拿出應急方案。

46完善醫療保險和意外傷害保險

頂崗實習學生由于身份受限，無法與企業簽訂勞動合同，勞動受傷無法按工傷保險條例進行補償，只能通過購買商業保險來預防此類意外的發生，其費用可由學校、企業、學生商討決定。

參考文獻：

[1]喬宏哲高職學生頂崗實習權益保障風險分析及防范對策[J].黑河教育，2011

[2]徐志剛頂崗實習：學生權益存隱患教育與職業，2009（8）.

[3]郭永生淺析校企合作模式――頂崗實習[J].中國市場，2013（45）.

篇（2）

中圖分類號：X24 文獻標識碼：A 文章編號：2095-624X（2017）01-0022-01

1.r值沖突

環境保護是屬于公共物品的范疇，準確地說是屬于非排他性但具備競爭性的公共物品，也就是人們常說的“公地悲劇”“公共池塘”。依目前的情形來看，環境保護正處在產品供給不足期間，即政府無法滿足居民對環境質量的高需求。其原因在于公共產品的提供僅僅是對價值的選擇、對利益偏好的選擇，不能同時滿足所有人的價值取向。這表明一部分人可以在價值上獲得滿足，而另一部分人則要作出價值犧牲。價值滿足群體與價值犧牲群體所追求的價值目標是相互對立的、相沖突的。

從環境保護政策執行的價值視角出發分析公共政策的相關行為主體的價值沖突，可以更好地理解政策在執行過程中出現的扭曲和失誤。

政策的順利執行將反映決策者的價值取向，若所作出的價值選擇只能滿足大多數人的利益，在這個過程中價值利益得到滿足和實現的則是價值滿足群體，價值利益受到損害或未能實現自身利益的則是價值犧牲群體。但是在實際的政策執行過程中，價值滿足群體有可能因為執行的扭曲而成為價值犧牲群體，未能從政策中受益。反之亦然。

2.個人利益―公眾利益分析

在環保政策問題上，我們往往看到的政策執行是根據執行者的主觀意愿使其達到他們所謂的價值最大化的。因為政府官員都有雙重身份：作為有私人權利和個人利益的個體，作為公共權力的行使者代表公共利益[1]。公共權力的誘惑性特征使少數行政官員在政策執行過程中利用公共權力損害公共利益而謀取私利。

地方政府為了尋求更好的政績，促進地區經濟發展，廣泛地招商引資，但是引資進來的企業往往是污染嚴重的或者是無法繼續生產而被關閉的企業。

作為公共利益的一方希望能盡快降低污染，走循環經濟的道路，促進社會的可持續發展；而有些地方官員則更多地從自身利益出發，追求短期的經濟效益，鼓勵繼續發展生產。所以說，要使政策執行者在執行政策的過程中始終保持絕對的“價值中立”實際上是難以做到的。如果一項公共政策威脅到自身利益，那么執行者無論出于公心或者私心，都有可能抵制這一政策，因而就使得該項政策很難順利有效地得到執行[2]。

3.成本―收益分析

從成本―收益分析來看，環境保護政策在執行過程中，地方政府能通過低耗能、低污染的燃料來生產產品、降低污染，但人們往往更看重在高污染環境下生產出的產品所獲得的超過以低耗能方式生產出的收益，即使周圍的一小部分人要忍受污染物的侵害。倘若每一個人都是利己者，那么將所有人產生的快樂（從產品中獲得的收益）加起來，它會超過周圍居民所受的痛苦。但是產品的實際收益的考量應該顧及因產品生產所導致的他人痛苦和遭遇，如水質污染。在現實中，收益卻往往無法得到很好的衡量，這也是問題的關鍵所在。

4.分析公共政策執行的價值沖突的啟示和意義

公共政策的執行不可能是一帆風順的，即使所制定的公共政策近乎完美。公共政策執行過程中如何協調各方利益，促進正面價值的實現，規避負面價值，促使公共政策更加有效地執行，還有一段很長的路要走。和諧社會需要堅持科學發展觀，走可持續發展的道路。所以，在環境保護問題上，我們應該追求綠色的GDP，走資源節約型、環境友好型的循環經濟模式，并將其作為對政府官員政績的考核內容；各級環保部門實行垂直管理，人事任免權交由上級環保機構，官員直接對其負責，賦予環保局更多的執法權力和執法力度；完善生態環境保護法規體系和管理體制，開展生態環境教育，鼓勵公眾參與環境保護，提高全民的環保意識；更重要的一點是將環境保護作為產業來開發，通過引用市場激勵機制，對逐漸稀缺的資源征收適當的稅收（對因環境污染所造成的損失征收一定的稅收，以彌補他人的損失）；也可以將某地區的環境保護責任托付給某一個體或集體，并對其進行管理。這些都將有利于環境保護政策的有效實施，改變“污染能賺錢，不污染不能賺錢”的怪現象。

篇（3）

【摘要】在靜態圖像上嵌入數字水印可以公示所有權，數字水印可以在靜態圖像著作權被侵犯時作為糾紛中的證據。借鑒國外立法與實踐，總結我國經驗，應充分靈活運用數字水印技術，保護靜態圖像著作權，發揮其人文、藝術價值。

關鍵詞 數字水??；靜態圖像；著作權保護

According to the static state picture work power of the numeral watermark protection research

Zhu Jin yi

【Abstract】Imbeding numeral watermark on the static state picture can Mr. show ownership， numeral watermark can at the static state picture work power drive infringe upon Be the proof in the dispute.Draw lessons from abroad lawmaking and practice， summary our country experience， should full use flexibly numeral watermark technique， protection the static state picture work power， exertive its humanities， art value.

【Key words】Numeral watermark;Static state picture;Work power protection

一、數字水印概況

（一、數字水印的概念

有學者認為在使用者對靜態圖像著作權者造成損害而感到困擾的時候，使用圖像時也會對其真實性和完整性產生懷疑。作為保護多媒體信息真實性、完整性的傳統加密技術存在缺陷，數字水印是作為加密技術的補充，在多媒體信息的著作權保護和完整性驗證方面得到迅猛的發展。

數字水印是可以以一種不容易被人所覺察到的手段插入一個或多個秘密信息，來實現隱蔽傳輸、存儲、標注、身份驗證、著作權保護等目的，并且這種方法不會影響到原載體的使用，為數字數據權利人所享有的權利提供保護的一種技術手段。當一個作品的著作權或所有權發生沖突時，可以提取嵌入原載體的水印來驗證其權威性。

（二、數字水印的特征

1、魯棒性（穩健性：

是指一個數字水印應能承受大量的改動，包括惡意處理和常規處理。惡意處理包括：慕改、偽造、 去除水印等。常規處理是指數字水印經過載體圖像的某種改動后，如經過JPEG壓縮、濾波、掃描與復印、剪切、打印、圖像增強、二次抽樣、噪聲污染、二次t化A/D.D/A轉換或幾何變換和幾何失真（如平移旋轉、尺度拉伸等等操作， 圖像視覺效果保持不變且仍能被提取出或證明其的存在。

2、安全性：

是指水印信息嵌入后隨機分布于圖像中，因其位置較隱蔽，能夠抵抗一些非法攔截和破解而使水印不被破壞、刪除或者竊取。

3、透明性（隱藏性：

是指加入水印的圖像和原始圖像基本上相同，載體圖像沒有明顯的降低質量的現象，且嵌入水印的數據經過隱藏處理在視覺或聽覺上不可感知。

4、通用性：

因水印信息嵌入于數據而非文件本身，好的水印算法適用于多種文件格式和媒體格式，即使文件格式變換，相關水印的數據也不易丟失，通用性在某種程度上意味著易用性。

二、基于數字水印技術的靜態圖像著作權保護的可行性

（一、靜態圖像著作權保護的重要性

生活中，商家會設計獨特的有個性的商標來代表自己的企業、公司等，而且最常用的就是用平面廣告來宣傳商品和活動。這種以靜態圖像為表現方法不僅清晰明了，而且可以通過巧妙的設計留給人們長久的印象，以及擴大產品的銷售量。平面設計、廣告設計公司或者工作室也數不勝數。而隨之當人們創新思維精神減弱、自主創新能力減退，對于設計較好的靜態圖像，就會非法使用、篡改該作品，甚至有以自己的名義進行發表公開發行的侵權行為的產生。

于是，當對于以靜態圖像為主要形式的作品的需求日益擴大，靜態圖像著作權保護的重要性日益凸顯。

（二保護其著作權的靜態圖像

根據《中華人民共和國著作權法》，該法所稱的作品主要包括以下9項：（1文字作品；（2口述作品；（3音樂、戲劇、曲藝、舞蹈、雜技藝術作品；（4美術、建筑作品；（5攝影作品；（6電影作品和以類似攝制電影的方法創作的作品；（7工程設計圖、產品設計圖、地圖、示意圖等圖形作品和模型作品；（8計算機軟件；（9法律、行政法規規定的其他作品。其中美術、建筑作品，攝影作品，工程設計圖、產品設計圖、地圖、示意圖等圖形作品和模型作品等可以歸為靜態圖像的范疇?？梢婌o態圖像占著作權法保護的客體比例較大。

（三靜態圖像著作權保護的權利主體

靜態圖像的權利主體，是靜態圖像專有權利益的承擔者。通常來說成為權利主體必須具備兩個條件：一是有獨立的人格，二是經法律確認。對于靜態圖像的權利主體的確認多數情況下并不困難。但是如果當以下情況發生的時候，筆者認為應當將嵌入數字水印認為即是登記的形式，具有對抗效力：

某甲發表靜態圖像，并嵌有宣示自己為該靜態圖像所有權人或者著作權人的水印，而當乙發現時宣稱自己才為該靜態圖像著作權人，與甲產生知識產權糾紛。

對于該種情況的發生，如果乙沒有足夠的證據證明自己為著作權人，則應當根據嵌入數字水印的時間的遲早判斷，認為嵌入數字水印相當于登記，具有創設和公式效力，判斷甲為該靜態圖像的著作權人。

（四靜態圖像著作權保護的權利內容

靜態圖像著作權保護的權利內容也就是靜態圖像的權利主體應當享有的權利種類，按傳統著作權理論可以分為精神權利和經濟權利。

1、精神權利

靜態圖像是一種以簡單形式來表現的智力成果。靜態圖像著作權人可以通過該種表現形式來表現自己的設計，或者通過畫面來表現抒發自己的情感。靜態圖像著作權人有權公開，有權要求對復制其作品的一方承認其系靜態圖像的著作權人。

2、經濟權利

權利人有權通過他人對其作品的利用獲得經濟報酬。所以靜態圖像著作權人可以通過自己對其擁有的著作權，利用其進行收益。比如平面廣告設計人可以通過為商家設計產品的平面廣告來收取經濟報酬，再由宣傳商利用其作品進行產品宣傳。經濟權的權利內容可以分為復制權、發行權、攝制權、播放權、展覽權等。其中靜態圖像權利主體主要通過復制權、展覽權獲取經濟利益。

（五靜態圖像著作權糾紛案例分析及思考

在網絡環境中的真實糾紛案例少見，多數在現實生活中發生糾紛。下列為案例舉例：

丁長祿是張家口市群藝館離休干部、中國攝影家協會河北分會會員，今年已73歲。2000年1月初，丁長祿在購買由張家口市人民政府、張家口市函件廣告局設計、制作、銷售及國家郵政局發行的2000年賀年（有獎明信片時發現，有一題為“中國張家口”的裝幀圖案，其主體畫面是盜用自己拍攝的展現張家口代表景觀“大境門”的景物照片《大好河山》。丁長祿認為，他作為《大好河山》作品的作者，依法對作品享有著作權，三被告未經許可，以贏利為目的，不署名使用作品，并對作品進行剪裁和添附，破壞了作品原有的完整性，故起訴到法院。法院經審理認為：攝影作品《大好河山》的作者是丁長祿，他對這一攝影作品享有著作權；張家口市人民政府是《中國張家口》2000年賀年（有獎明信片的設計者，因該明信片內容所產生的民事責任應由張家口市人民政府承擔；張家口市人民政府在未經丁長祿許可的情況下，對這一攝影作品進行修改及未給丁長祿署名的行為，侵犯了丁長祿對這一攝影作品所享有的修改權和署名權，應承擔相應的民事責任；國家郵政局作為2000年賀年（有獎明信片的發行者，并且在該明信片上也注明了“國家郵政局發行”，因此，國家郵政局應對明信片所涉及的著作權問題與張家口市人民政府共同承擔民事責任。法院依據《中華人民共和國著作權法》的相關規定，做出上述判決。

通過此案可以再次驗證靜態圖像因為形式簡單，容易被模仿、抄襲，可以通過技術手段再加以剪接、添加等篡改，而且又是因為其形式簡單，對于現實生活中靜態圖像著作權發生的糾紛較難進行解決。

三、國際基于數字水印的靜態圖像著作權保護的立法及啟示

不管發達國家還是發展中國家，經常會有對靜態圖像的使用，也不論其數字環境發展如何，在一定程度上，靜態圖像的著作權面臨著挑戰。對此，不少國家和組織做出過嘗試，針對數字環境下的知識產權執法出臺相應法律法規。在此我們主要討論國際在靜態圖像著作權保護上的立法及對我們的啟示。

在國際角度上，涉及著作權保護的公約主要有《反假冒貿易協議》（ACTA、《伯爾尼保護文學和藝術作品公約》（Berne Convention for the protection of Literary and Artistic works、《世界知識產權組織表演和錄音制品條約》（WIPO Performances and Phonograms Treaty等。

（一《反假冒貿易協議》與運用數字水印以期保護權利管理電子信息

《反假冒貿易協議》作為最新的知識產權執法國際標準，其核心內容第二章與《TRIPS協定》規定的知識產權執法大同小異，而最大的區別就在于ACTA規定了有關數字環境下的知識產權執法。在這里主要討論其規定的關于權利管理電子信息的義務方面的內容。

“權利管理信息”是指附著在作品、表演、錄音制品的復制品上的信息，或作品表演、錄音制品在向公眾進行傳播或者提供時所出現的信息，包括：1.識別作品、表演、錄音制品、作者、表演者、錄音制品制作者以及在作品、表演和錄音制品中的所有權利人的信息；2.有關作品、表演、錄音制品的使用的條款與條件的信息；3.代表上述信息的任何數字或代碼。并且在ACTA第27條第7款規定：“為了保護權利管理電子信息，締約方應規定充分和有效的法律救濟辦法，制止任何人明知或就民事救濟而言應知其行為會誘使、促成、便利或掩蓋對任何版權或鄰接權的侵害，卻未經授權而實施下列行為：（I去除或改變任何權利管理電子信息；（Ⅱ明知權利管理電子信息未經許可已被去除或改變，卻發行、為發行目的而進口、廣播、向公眾傳播或提供作品、表演、錄音制品的復制件?！?/p>

通過ACTA的相關規定，可以看出權利管理信息是提供作品的權利人等相關信息，保護好權利管理電子信息在一定程度上等于保護好作品的著作權。而且在第27條第7款也規定了為了保護權利管理電子信息，締約方應規定充分和有效的法律救濟辦法。對于本文靜態圖像著作權侵權的救濟辦法，數字水印是絕佳首選。數字水印既可以在作品中表現作品的著作權人等相關信息，又可以通過其魯棒性等特點，保護其權利管理電子信息。

（二《伯爾尼保護文學和藝術作品公約》與靜態圖像難以保護的原因分析

伯爾尼公約是世界上第一個國際版權公約，原始簽字國就有10國，是國家注重版權的國際保護的體現。

《伯爾尼公約》保護的作品范圍是締約國國民的或在締約國內首次發表的一切文學藝術作品。其中“文學藝術作品”有圖書、講課、演講、講道、戲劇、啞劇、舞蹈、樂曲、電影作品、圖畫、建筑、雕塑、攝影作品，實用藝術品，地理學、解剖學、建筑學或科學方面的圖表、圖示及立體作品等。其次還包括“演繹作品”，即翻譯、改編、樂曲整理，以某一文學或藝術作品的其他改造，只要不損害原作的著作權，這種改造就得到與原作同等的保護。圖書、圖畫、圖標、圖示等靜態圖像包含其中，公約既保護經濟權利也保護精神權利。

《伯爾尼公約》中有規定關于平面設計的保護，可見對于平面設計等靜態圖像的著作權保護開始上心?！霸谧袷乇竟s第七條第四款之規定的前提下，本同盟各成員國得通過國內立法規定其法律在何種程度上適用于實用藝術作品以及工業品平面和立體設計，以及此種作品和平面與立體設計受保護的條件。在起源國僅僅作為平面與立體設計受到保護的作品，在本同盟其他成員國只享受各該國給予平面和立體設計的那種專門保護；但如在該國并不給予這種專門保護，則這些作品將作為藝術作品得到保護。”

通過解讀，可以發現《伯爾尼公約》中，靜態圖像的保護并不注重，《伯爾尼公約》著重在于文學作品和音樂作品等上面，規定了有關文學作品和藝術作品專有權利和各國對其的保護措施。根據公約第七條的敘述，如果同盟的成員國對實用藝術作品平面設計和工業品平面設計沒有專門的保護，將作為藝術作品予以保護。而定性為藝術作品的話，在《伯爾尼公約》中的范圍稍稍廣泛了些，沒有較好的對應的規定，不如文學作品和音樂作品保護規定全面?？梢娮鳛楫敶鐣锰庉^多的可以呈現各種形式作品與設計想法的靜態圖像，其著作權在《伯爾尼公約》中不能得到全方位的保護。第一，從主體來看，靜態圖像的形式簡單，在數字環境中僅僅只有JPG、BMP等格式，容量小、儲存簡單，在現實中可能也只是一張紙的份量，不如其他作品的表現時所需步驟復雜。第二，靜態圖像其著作權認證困難，創造一份以靜態圖像為表現形式的作品所需要的時間較少，并且靜態圖像容易復制，以至于在知識產權糾紛中，靜態圖像的著作權很難確定。第三，公約的規定有一定程度上的口號的意味，沒有很多地對保護作品著作權的相關機構的職責與職能的規定，也就限制了對以靜態圖像為表現方式的作品的著作權保護水平。

（三《世界知識產權組織表演和錄音制品條約》與靜態圖像著作權人精神權利

該條約制定所保護的客體是表演和錄音制品，但是其中的條款對于靜態圖像的保護有很好的示范和借鑒作用。

篇（4）

這次，我和動植物專家陳慶一起前往臨滄市，在當地向導的帶領下，深入保護區的核心區域，希望通過親身考察，了解目前保護區的森林資源基本狀況，同時還希望通過紅外相機，拍攝到一些珍稀動物的影像。

1 路邊小飯館的新奇食材

路邊有家小飯館，看上去有些簡陋，但菜肴所用食材很新奇，像“獨角仙”、“地雷蜂”等名字有些嚇人的昆蟲，在這里都成了美食。

天蒙蒙亮，我們乘車從昆明出發前往臨滄市。半個月前，我曾隨綠色和平組織去過那里，調查天然林遭破壞的狀況，那是我第一次去到南滾河保護區南側，根據對海拔、地勢和林木的生長方向的分析，我判定在南滾河流域內，有一片保存較好的原始森林。

陳慶是動植物專家，他在路上沒有絲毫疲倦，總是拿著手機朝車窗外拍照。出發前，我的慢性咽炎就發作了，一路上咳嗽不止，只能不停地喝水來緩解喉嚨的癢痛。到吃午飯時，汽車停在了一個三叉路口，邊上有家小飯館，看上去有些簡陋，但菜肴所用食材很新奇，像“獨角仙”、“地雷蜂”等名字有些嚇人的昆蟲，在這里都成了美食?？吹斤埖昀习屦B了蜂，陳慶便從蜂巢里捏出一只剛羽化的幼蟲，對我說：“吃了它，咳嗽會好點?！蔽医舆^這只肉白色的幼蟲，放在嘴里輕輕一嚼，一股濃郁的苦澀味瞬間充滿了口腔，一連吃了幾只后，我的嗓子果然舒服了很多。飯店老板見狀，讓我喝了一杯用樹葉泡的茶，并說：“你吃得太多了，喝杯這種茶水，不然一會胃會疼?！标悜c入鄉隨俗，點了一份竹鼠辣椒飯，而我還是只吃了一碗泡面。

下午6點，我們到達目的地，與當地向導阿榮匯合。阿榮只有19歲，但陳慶看到他走路的樣子，就對我說他是走山路的好手。吃晚飯時，阿榮要了一瓶白酒，他邊喝酒邊給我們介紹了保護區的基本情況，他說：“南滾河自然保護區在全國知名度不高，外界對其了解很少，但在保護區的核心區有許多珍貴動物，正是這個原因，現在深入核心區偷獵的人日益增多，不少野生動物不得不離開核心區，開始向游蕩……”此后他還特意叮囑我們說：“早在上世紀50年代末，山里的林子就開始遭到砍伐，現在不少地方的山是光禿禿的，我們不要往南走得太深，在那邊遇到當地獵人會很麻煩，他們當中很多人都是無業人員……”我明白，阿榮是擔心我們被搶劫。

2 營地突遇眼鏡王蛇

那條眼鏡王蛇不停地吐著信子，發出令人寒顫的“咝咝”聲。此時，一人一蛇就像兩個正在的武士，眼睛直直地盯著對方，誰也不敢轉移視線。

第二天清晨，我們整理好物資和設備，在當地背夫的幫助下，向保護區出發。我們沿著泥濘的山路艱難地走了幾小時，到達山溪邊的一處空地，商量后決定將這里作為本次考察的大本營，背夫卸掉物資和設備后，我們就開始收拾各自的行李。就在砍伐竹子來支撐防水布的時候，陳慶突然驚呼起來：“眼鏡王蛇！”我回頭看去，只見陳慶拿起身邊砍下的竹竿，迅速擺出防御姿勢，眼鏡王蛇受到驚擾，也立馬豎立起脖子，口中不停地吐著蛇信子，發出令人寒顫的“咝咝”聲。此時，一人一蛇就像兩個決斗的武士，眼睛直直地盯著對方，誰也不敢轉移視線。我在一旁興奮地喊道：“阿榮，能不能抓住它！”他卻回答道：“你不知道，這種毒蛇殺了我們這里的多少獵人。”我本來還著迷于這種世界上最大的毒蛇，但聽到阿榮這么一說，也只得放棄了近距離拍攝的念頭――我很清楚，萬一被毒蛇咬到，其毒液會讓我在短短一分鐘之內昏迷，如果不及時救治就會危及生命。

此時，陳慶用竹竿控制住了他與蛇的距離，而那條眼鏡王蛇直立的身子，幾乎和陳慶的胯骨一樣高，并不停地張嘴恐嚇，隨時準備攻擊。根據經驗判斷，眼鏡王蛇在張大嘴巴時，并不想真正進攻，或許是我們在砍竹子時，不小心誤入了它的巢穴，而它只想嚇走我們，如果我們現在將其趕走，它很有可能還會回來，因為它的老巢就在這附近。因此繼續在這里扎營已不是明智之舉，但此時背夫已經下山，我們無法臨時更換營地。正當我們不知如何是好，阿榮說：“只要我們晚上將火生起，蛇自然就會搬家?！苯┏至藥追昼姾?，那條眼鏡王蛇看我們沒有離開的意思，終于掉頭朝山溪對面游過去，當它的身子全部暴露在外時，我們目測到其體長竟超過3米！

搭好營地，阿榮獨自去挖竹筍，我和陳慶則到對面山坡上去安放紅外相機。突然，叢林深處傳來一聲好像石頭落水的聲音，陳慶警覺地說：“不對，這是獵槍的聲音。”據我的朋友講，他此前在保護區調查食肉動物時，就有安裝在樹上的紅外線相機被獵人用槍打爛。這里的獵人通常以靈貓類和偶蹄類動物為狩獵對象，靈貓類動物主要生活在長有大片果樹的區域，而像野豬、黃麂這樣的偶蹄類動物，則大多出現在鹽堿地周邊，因此果樹區和鹽堿地都是獵人活動頻繁的區域，我們決定避開這兩類區域，謹慎選擇安放位置。

在野外安放紅外相機，除了要避免人為破壞，還需注意很多小細節。最令人頭痛的是――昆蟲能通過遺留在相機表面的汗液嗅到鹽分，發現安裝的相機。如果蛾子的翅膀擋住了接收器，就會導致相機不停地拍攝，嚴重損耗電量，影響其正常工作。因此在安裝結束后，我們還專門用棉花蘸上清水，將相機仔細地擦拭了一遍，清洗掉遺留鹽分，避免昆蟲前來搗亂。

3 鹽堿地蹲點拍攝

不知過了多久，正當我用手扯下一只爬到臉上的螞蟥時，鹽堿地對面的林子里有了動靜，阿榮用手勢朝我暗示：有什么動物來了……

第三天早晨醒來時，我覺得脖子后面有些僵硬，睡袋好像緊緊地粘在了皮膚上。我伸手一摸，手上就沾滿了鮮血，瞬間便反應了過來：脖子里肯定鉆進了螞蟥。我迅速起身翻開睡袋，只見一只吸飽了我血液的螞蝗，身體膨脹得碩大，吸盤上正往外滴血，我撿起螞蝗扔進了火堆，處理傷口。

今天，阿榮要帶我們去一片距離營地大約8公里的鹽堿地，到那里蹲守拍攝偶蹄類動物。早飯吃了幾塊臘肉，我們便沿著泥濘小路出發，樹葉在頭上掠過，時時有螞蝗掉落在身上，每走50米左右，我們就要停下來檢查，把掉在身上的螞蟥彈開。

突然，前方林子里傳來一陣隱約的交談聲，阿榮用當地話大喊了一聲，林子里很快走出來兩個人，他們一人肩上扛著自制的獵槍，一人手上拎著一只還在滴血的動物，這兩人是阿榮的朋友，相互打了招呼后便聊了起來。那人告訴我們，他拎的是一只小赤麂，保護區周邊山里的獵人很多，有時還有從緬甸那邊過來的獵人，他們都想抓最值錢的動物，打到其他不值錢的，要么自己吃，要么拿到集市上換點酒錢。

同獵人告別后，我們繼續前行，一小時后到達鹽堿地。雨林中，許多動物會經常前往鹽堿地，通過啃噬鹽堿地中的泥土來補充身體所需的鹽分。這塊鹽堿地大小與籃球場相近，里面除了留有獵人雜亂的腳印外，還有一些水鹿和野豬來過的痕跡。我們拿著相機隱蔽在樹叢中，靜靜地等待動物的光顧。

不知過了多久，正當我用手扯下一只爬到臉上的螞蟥時，鹽堿地對面的林子里有了動靜，阿榮用手勢朝我暗示，意思是來了一群山雞，叫我準備好拍攝，當領頭的山雞謹慎地走向鹽堿地中央時，我才看清那其實是一群白鷴。曾幾何時，白鷴是極其普通的鳥類，在我國很多地方都能見到，但由于生態環境的惡化和人類的大肆捕殺，如今已很少見到其身影。在接下來的時間，我們只拍到了一些常見的動物，并沒有特別的收獲?；貭I地的路上，我在一棵樹上看到幾道陳年爪印，阿榮告訴我：“這些都是虎、豹等大型動物，為了標識自己的領地范圍而留下來的?！?/p>

陳慶取回在野外安放了數天的紅外相機，連接上電腦打開照片，看到果子貍、豪豬等白天不易見到的小型動物都被拍到，這比我們在鹽堿地蹲點拍攝收獲大多了。傍晚聊天時，我問阿榮：“現在這個地方還有老虎嗎？”他肯定地回答道：“我保證沒有，我們這邊的獵人已經很久沒見過老虎留下的蹤跡了。如果想見到老虎，就必須冒險前往緬甸，甚至從緬甸再往西才能看到?！眲傉f到此，阿榮忽然望著距離營地不足50米遠的一棵樹，他拿起手電照射過去，興奮地說：“是椰子貓?！?/p>

4 保護區現狀令人堪憂

大型貓科動物對生存環境的要求非常苛刻，它們不僅要有足夠的食物來源，還要有大面積的棲息地。

我們在調查時發現：在保護區內，動植物之間建立起了緊密的生態關系：小型動物以叢林中的成熟果實為生，并通過排便傳播種子，與之保持共生關系。而生活在地面上的豹貓、豬獾等食腐性動物主要吃動物腐肉，這樣能抑制森林疾病的傳播，保證保護區內生態系統的良性循環。同時，大型食肉動物生活在食物鏈的頂端，它們捕殺小型動物，控制其數量，保證保護區生態系統的正常運轉，并維持其生態平衡。如今，長期偷獵導致野生動物逐漸減少，同時，人類對森林的破壞讓動物失去了棲息地，保護區內的生態系統正在慢慢失去平衡。

篇（5）

超分子化合物是微觀單元以非共價鍵弱相互作用力結合而成的有序締合體 [1-2]。超分子化合物具有識別、記憶、變換和傳輸等功能，因此在藥物、光化學分子器件、膜材料[3-5]等方面應用廣泛。其中藥物包合物是超分子研究內容的獨特領域，研究藥物包合體系中分子間的相互作用機制，可為進一步深入理解包合物的理化性質、主客體包合反應機制以及包合物選擇性結合受體的識別機制提供依據，藥物包合物已成為當前超分子領域研究的熱點。

脫氧土大黃苷（DES，結構式見圖1）主要來源于天山大黃的蓼科植物，為二苯乙烯衍生物，屬于茋苷。DES在抗腫瘤、抗氧化、降低II型糖尿病的血糖及提高機體免疫力等方面有顯著療效。但DES的水溶性極差，極大限制了該藥物在制劑上的開發應用。如將其制備成超分子包合物，可增加水溶性、提高穩定性，達到改善藥物生物利用度的目的。而制備具有實用價值的DES包合物，選擇一種理想的藥物包合載體材料為關鍵之一。

β-環糊精（β-CD，結構式見圖1）在環糊精種類中應用最廣[6-8]。適宜的空腔大小使β-CD成為近年發展起來的新型藥物包合材料。β-CD以疏水性空隙經范德華力及非傳統疏水作用力容納或插入藥物分子，形成的藥物包合物又稱“分子膠囊”，可不同程度改善藥物溶解性，降低外在條件對藥物分子的影響，提高藥物的穩定性。目前已有大量有關環糊精包合藥物的報道[9-13] ，但對藥物包合物理論、包合物的結構分析等還有待開展深入的研究。

本研究選擇DES為客體，含有7個葡萄糖分子的β-CD為載體，合成包合物并進行分析鑒定[14-29]，確定包合比、計算理論參數，為該類藥物超分子包合物的研究奠定前期基礎。目前，β-CD-DES包合體系的研究未見文獻報道。

1 材料

F-4500型熒光光度計（Hitachi，日本）；UV-2450型紫外-可見分光光度計（Shimadzu，日本）；DZF-6020型真空恒溫干燥箱（上海林頻實驗設備有限公司）；PS-1000型磁力攪拌恒溫水浴槽（Eleya，日本）。

脫氧土大黃苷（≥96%，賽納斯特化學）；β-CD（≥96%，上海阿拉丁試劑公司）；無水乙醇（≥99.7%，天津市永大化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。試驗用水均為二次蒸餾水。

2 包合物的制備及表征

2.1 β-CD-DES包合物的制備 DES 0.02 g 溶于50%乙醇，β-CD 0.5 g溶于60 ℃二次蒸餾水。將DES溶液緩慢滴入β-CD溶液中，60 ℃回流并攪拌反應2 h。反應液冷卻至室溫后過濾，沉淀用乙醇、蒸餾水洗滌數次，100 ℃恒溫干燥5 h。

2.2 標準曲線的繪制 50%乙醇配制DES對照液 （20～50 mg·L-1），紫外掃描并在λmax 300 nm波長處讀取其吸光度，繪制DES的濃度（c）～吸光度（A）標準曲線，數據擬合獲得標準曲線的線性回歸方程。β-CD在200～400 nm無紫外吸收，對DES的紫外-可見吸收光譜無干擾。測定β-CD-DES包合物體系的吸光度，利用DES的標準曲線計算游離DES的濃度，進而計算包結比等參數。

2.3 熒光光譜表征 熒光光譜儀在λex 260 nm，λem500～600 nm分別測定1.2×104mg·L-1的β-CD，DES，β-CD-DES （物理混合）和β-CD-DES包合物體系的熒光發射譜，比較分析光譜特征獲得β-CD-DES包合物體系的熒光表征譜。

2.4 包合物的包合率測定 定量包合物溶于50%乙醇，在最大吸收波長處測其紫外吸光度，由標準曲線的線性回歸方程計算DES的濃度，代入公式（1）計算包合率。

2.5 包合反應包結比及熱力學函數的測定 分別配制30，60，90，120，150 mg·L-1 β-CD對照液，測其熒光光譜，按Hildebrand-Benesi方程以1/（F-F0）對1/[β-CD]n作圖，求算包結比及反應熱力學函數。

3 結果與討論

3.1 DES與β-CD 的包合過程 β-CD包合DES反應方程式見圖2。

β-CD分子略呈錐形的中空圓筒立體環狀結構，使得環糊精具有外親水內疏水的特性，這種特性使得環糊精能夠包合各種形狀大小與環糊精內腔相匹配的疏水性客體分子，以此提高客體分子的溶解性及穩定性。

3.2 標準曲線 對DES對照溶液在300 nm波長處的吸光度進行測定，數據擬合獲得線性回歸方程為c=0.051 3+0.003 5A（r=0.995 2，SD=0.004 1， n=7， P

3.3 熒光光譜分析 DES，β-CD-DES包合物，β-CD-DES （物理混合）和β-CD的熒光發射譜見圖3。DES形成β-CD-DES包合物后出現明顯的熒光猝滅現象，表明DES分子嵌入β-CD的環狀圓筒結構中，溶液中游離態DES濃度降低，導致熒光強度降低。而β-CD-DES（物理混合）只是簡單的2種化合物物理混合，與β-CD熒光譜圖幾乎沒有差別，這是因為溶液中含有過量β-CD和微量DES，所以混合物的熒光強度主要以游離β-CD的熒光強度表現出來，表明物理混合中藥物未被環糊精包合。

圖3為固定激發波長條件下，體系的發射熒光強度與掃描發射波長關系的二維熒光光譜圖?？陀^上體系的熒光強度與激發波長、發射波長均有關系，應該是一種三維函數譜，即三維熒光光譜更能詳細描述藥物包合物體系的結構特征變化。β-CD，DES，β-CD-DES （物理混合）和β-CD-DES包合物的三維熒光譜見圖4。

從圖4可見，β-CD與DES的3D熒光譜各有其特征，β-CD的熒光發射譜中出現多個指紋峰，但強度明顯弱于DES的3D指紋峰。β-CD-DES（物理混合）包含了完整的DES特征指紋峰，說明β-CD與藥物DES的物理混合沒有引起藥物的任何改變，即沒有形成有效包合物。β-CD-DES包合物中保留了β-CD的特征指紋峰，DES的特征指紋峰發生明顯變化。其中，圖4（B）圖中的峰4未出現在圖4（D）中，峰5發射波長藍移了7 nm，且熒光強度減弱，表明分子間作用力形成的復合物改變了藥物體系的空間結構。由此判斷成功合成包合物，這與二維熒光法測得的結果相符。

3.4 包合物的包合率 包合物顆粒細小，顏色介于β-CD和DES之間。將測得包合物的吸光度代入標準曲線方程式，進而由公式（1）求得包合物的包合率為38%。

3.5 DES與β-CD的包結比及結合常數 結合常數是衡量主體β-CD與客體藥物包結能力的大小，可以表征包合物的穩定性及包合反應的難易程度。在主體濃度大于客體濃度條件下，可采用Hildebrand-Benesi公式（2）獲得包合物的結合常數。

式中，F為不同濃度β-CD的熒光強度；F0為客體DES熒光強度；F∞為包合物的熒光強度。將試驗數據按1/（F-F0）對1/[β-CD]n （n=1，2，3……）作圖，由直線的截距與斜率可求得結合常數K。

根據公式（2）做試驗數據擬合圖，n取值1～5。從擬合結果看，當n=2時，1/（F-F0）對1/[β-CD]2作圖效果最優，獲得良好的線性關系，說明主客體間形成2∶1的包合物，1/（F-F0）對1/[β-CD]2的關系見圖5。

從圖5可見，不同溫度條件下，1/（F-F0）～1/[β-CD]2的線性關系良好（r>0.990 0），線性回歸方程見表1，說明β-CD-DES包合物的包結比為2∶1。包合物的結合常數見公式（3）。

式中，[DES]為被包合藥物的平衡濃度；[β-CD]為溶液中環糊精的平衡濃度；[β-CD-DES]為包合物的平衡濃度。計算不同溫度條件下[β-CD-DES]包合物的結合常數，結果見表1。

由表1可見，求得的結合常數較大，且隨溫度升高而增大，說明β-CD包合DES生成穩定復合物。

3.6 DES與β-CD包合反應熱力學函數 根據熱力學公式ΔG0=ΔH-TΔS0，ΔG0=-RTlnK結合van′t Hoff公式，由結合常數的對數值lnK對溫度的倒數1/T作圖，可得出不同溫度下的熱力學函數，結果見表2。van′t Hoff公式見下。

由表2可知，吉布斯自由能G0

3.7 包合物的偏振度及各向異性 偏振熒光是熒光分子在偏振光激發下發射光發生變化的偏振光譜。通常用偏振度P和各向異性r表示。

式中G為校正因子（G=IHV /IHH），IHV和IHH分別為水平偏振光激發下的垂直偏振發射光強度和水平偏振發射光強度，IVV和IVH分別為垂直偏振光激發下的垂直偏振的發射光強度和水平的發射光強度，P和r的計算結果見表3。

熒光體的轉動速度與偏振度P成正比，偏振度越小，熒光體轉動速度越快。由表3可見，β-CD-DES（物理混合）的偏振度P及各向異性r與β-CD相比，幾乎沒有發生改變。而β-CD-DES包合物的P及r較β-CD均有較為明顯的提高（分別提高了0.030，0.042）。說明β-CD-DES包合物由于藥物嵌入環糊精空腔內，分子間相互作用使超分子體系穩定性增強，復合物體積變大，熒光體轉動速度變緩，體系黏度增大而使偏振度增大。偏振熒光法定量證明了β-CD-DES包合物的形成。

3.8 DES與β-CD包結物的結構推測 研究證明分子結構是藥物與β-CD相互作用的重要因素。DES具有2個疏水苯環，雖然分子的空間位阻不大，但要完整的包合藥物小分子，客體分子所需的空間會超出單個環糊精分子的容納空腔。由Hilde- brand-Benesi方程，1/（F-F0）對1/[β-CD]2呈現良好的線性關系，得出主客體包結比為2∶1，推測包結過程見圖6，可能的結合形式有4種。

β-CD分子的小口端由7個伯羥基組成，大口端由葡萄糖單元2，3位的14個仲羥基組成。由于氫鍵作用環糊精分子排列成“籠狀”或“管狀”，客體分子被包埋其中，可能有以下4種不同構型：脫氧土大黃苷分子大頭（含葡萄糖基與酚羥基）插入β-CD的小口端，小頭（含甲氧基苯環）插入β-CD的大口端（圖6A）；脫氧土大黃苷分子大頭插入β-CD的大口端，小頭插入β-CD的小口端（圖6B）；脫氧土大黃苷分子大頭插入β-CD的大口端，小頭插入β-CD的小口端（圖6C）；脫氧土大黃苷分子大頭插入β-CD的小口端，小頭插入β-CD的小口端（圖6D）。

4 結論

本試驗成功制備脫氧土大黃苷-β-環糊精包合物，通過光譜試驗結合理論計算方法對包合物超分子體系進行深入探討，得到包合物熱力學函數及主客體包結比，氫鍵、范德華力為β-CD-DES包合物主要驅動力。試驗數據說明，包合反應自發進行，包合物形成后體系的能量降低，生成穩定包合物超分子體系，藥物的熱穩定性及溶解性能均有明顯提高，達到了預期效果。

另外，結合藥物及載體空間構型，本研究推測出β-CD包合DES的4種類型，理論分析了包合反應的可行性。由于本實驗室的量子化學計算資源有限，包合物的穩定構型有待進一步深入研究，但已開展的研究工作對環糊精-藥物包合物體系中分子間相互作用作了一定程度的探討，可為脫氧土大黃苷在醫藥方面的應用提供有關參考。

[參考文獻]

[1] Steed J U， Atwood J L. 超分子化學[M]. 北京： 化學工業出版社， 2006.

[2] 麥松威. 高等無機結構化學[M]. 北京： 北京大學出版社， 2001.

[3] Dana A U， Kat J P， Luc B. Combining supramolecular chemistry with biology[J]. Chem Soc Rev， 2010（39）： 2817.

[4] Chen C F. Novel triptycene-derived hosts： synthesis and their applications in supramolecular chemistry[J]. Chem Commun， 2011（47）： 1674.

[5] Li Y， Park T， Quansah J K， et al. Synthesis of a redox-responsive quadruple hydrogen-bonding unit for applications in supramolecular chemistry[J]. J Am Chem Soc， 2011， 133（43）：17118.

[6] Volobuef C， Moraes C M， Numes S， et al. Sufentanil-2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex for pain treatment： physicochemical， cytotoxicity， and pharmacological evaluation[J]. J Pharm Sci， 2012， 101（10）： 3698.

[7] Haruyasu A， Takuya L， To Toshiyuki K， et al. Unique catalytic effect of a cyclodextrine host on photodimerization of coumarin in nonpolar solvents[J]. Tetrahedron Lett， 2013，54（7）： 688.

[8] Wang J， Cao Y， Sun B， et al. Physicochemical and release characterization of garlic oil-β-cyclodextrin inclusion complexes[J]. Food Chem， 2011， 127（4）： 1680.

[9] 馬君義， 張繼， 魏相龍， 等. 百里香揮發油β-環糊精包合工藝研究[J]. 中國現代應用藥學， 2012， 29（5）： 422.

[10] Toshiyuki K， Takuya L， Yoshinori F， et al. Strong guest binding by cyclodextrin hosts in completing nonpolar solvents and the unique crystalline structure[J]. J Am Chem Soc， 2011， 13（17）： 4570.

[11] 何仲貴. 環糊精包合物技術[M]. 北京： 人民衛生出版社， 2008.

[12] 王亮， 郭成功， 王彩旗. 基于β-環糊精和二茂鐵主客體作用的超分子聚合物的制備及其凝膠化[J]. 功能高分子學報， 2012， 21（5）： 335.

[13] 馮瀚洲， 胡春暉， 朱春燕. 桉葉油羥丙基-β-環糊精包合物-原位凝膠復合系統的制備與評價[J]. 中國現代應用藥學， 2012， 29（2）： 142.

[14] 陳方偉， 郭濤， 李海燕， 等. 雙氫青蒿素羥丙基-β-環糊精包合物的制備與表征[J]. 藥學學報， 2012， 47（4）： 529.

[15] 樊志， 刁春華， 宋海濱， 等. β-環糊精與水楊酸包合物的合成與結構[J]. 化學學報， 2007， 65（15）： 1449.

[16] 李申利， 劉翠格， 魏永臣. 土大黃苷的熒光光譜在其中藥大黃分析中的應用[J]. 光譜學與光譜分析， 2008， 28（10）： 295.

[17] 李振， 高振坤， 龍君江. 鹽酸沙拉沙星-β-環糊精包合物的制備[J]. 西北農林科技大學學報： 自然科學版， 2013， 41（3）：1.

[18] 李滿秀， 趙二勞， 薛園園. β-環糊精增敏熒光法測定氯氰菊酯的研究[J]. 分析科學學報， 2007， 23（5）： 592.

[19] Sergry V， Kurkov E， Ukhatskaya T L. Drug/cyclodextrin： beyond inclusion complexation[J]. J Incl Phenom Macro， 2011， 69（3/4）： 297.

[20] Williamson B， Krishnaswamy R， Tonelli A E. Physical properties of poly（ε-caprolactone） coalesced from its α-cyclodextrin inclusion compound[J]. Polymer， 2011， 52（20）： 4517.

[21] 張倩， 張晶， 周欣， 等. 羥丙基-β-環糊精對他克莫司的增溶作用[J]. 中國藥房， 2010， 21 （25）： 2339.

[22] 葛竹興， 張小華. 甲砜霉素-羥丙基-β-環糊精包合物的制備和鑒定[J]. 南京師范大學報： 自然科學版， 2008， 31（4）： 74.

[23] 郭麗蓉， 周麗玲. 冰片-β-環糊精包合物制備方法的比較研究[J]. 時珍國醫國藥， 2011， 22（6）： 1462.

[24] 趙燕燕， 李麗， 劉宇， 等. 阿魏酸環糊精包合物的制備及體外經皮通透性的評價[J]. 中國醫藥工業雜志， 2010， 41（5）： 339.

[25] Eki S， Tao L， Liu J Q， et al. Bioderadable star polymer functionalized with β-cyclodextrin inclusion complexes[J]. Biomacromolecule， 2009， 10（9）： 2699.

[26] 肖玉梅， 王健， 劉吉平， 等. β-環糊精丁吡嗎啉的包合作用[J]. 高等學?；瘜W學報， 2009， 30（4）： 720.

[27] 張毅民， 李瀟， 孫聰善， 等. 羥丙基-β-環糊精/格列吡嗪包結物的制備及其光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析， 2008， 28（3）： 71l.

[28] 胡勇， 凌鵬遠， 徐金瑞. 環糊精與溴氰菊酯包合作用的紫外光譜法研究[J]. 廣東化工， 2012， 17（39）： 36.

[29] 蔣永海， 朱輝. 婦炎消膠囊中非法成分土大黃苷的檢測[J]. 中國現代應用藥學， 2011， 28（10）： 959.

Study on preparation of deoxyrhaponti-β-cyclodextrin super-molecular

inclusion complex and performance of inclusion complex

GUO Ming*， WANG Chun-ge， YIN Xin-xin， DU Hong-chen

（School of Engineering， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）

篇（6）

[中圖分類號] R541.78 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-38-02

The Brain Protective Effect of Different Dose Edaravone by Ear Intravenous Injection in CPR Rabbits

LIU Lin1 CAO Huanjun1 ZHANG Chengming1，2

1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical College；2.The Department of Anesthesia，Weifang Medical College Affiliated Hospital，Shandong 261042

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of edaravone on brain in the rabbits by cardiopulmonary resuscitation. Methods30 rabbits were randomly divided into three groups：NS，low-dose edaravone-treated and high-dose edaravone-treated groups. Each group had 10 animals. The contents of SOD and MDA in serum were assessed 30min，2h，4h after the cardiopulmonary cerebral models were established. ResultsCompared with the NS group，serum SOD in edaravone groups were significantly higher，but serum MDA in edaravone groups were significantly lower；Compared with group S，the serum SOD in group H was significantly higher，serum MDA of group H was significantly lower. ConclusionEdaravone has protective effect on brain in the rabbits after cardiopulmonary resuscitation，especially the high dose.

[Key Words]Edaravone； Cardiopulmonary resuscitation； Brain protection； MDA； SOD

心肺復蘇是危重疾病的搶救和治療過程中經常遇到的問題，復蘇成功后由于長時間的缺血缺氧，腦組織可能造成不同程度的損傷。目前認為缺血再灌注后氧自由基增多是導致腦損傷加重的主要原因[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等是反映氧自由基水平的主要觀察指標。依達拉奉（3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮）是新一類羥自由基清除劑，臨床上主要用于腦梗死的治療。各項實驗研究證實，依達拉奉對缺血性腦損傷有保護作用[2，3]，能改善缺血性腦損傷患者神經功能的預后。本實驗擬通過檢測家兔血清SOD、MDA水平的變化，旨在評價不同劑量的依達拉奉液對心肺復蘇后家兔腦組織的保護作用，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

（1）主要試劑：超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

（2）儀器：微量注射器（寧波市三愛儀器廠）；4°離心機（上海安亭科學儀器廠）；722s分光光度計（上海精科公司）；DW-2000動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司）；PM- 9000便攜式多參數監護儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

1.2 實驗動物及分組

5月齡健康家兔30只，雌雄不拘，體重（2.50±0.30）kg，由濰坊醫學院實驗動物中心提供。實驗動物用隨機數字表法分為3組：生理鹽水組（N組）、小劑量依達拉奉組（L組）、大劑量依達拉奉組（H組），每組10只。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作 心肺腦復蘇動物模型的制作參照文獻[4，5]進行。實驗前禁食12h，耳緣靜脈推注氯胺酮10mg/kg誘導，氯胺酮100mg加入250mL林格氏液內靜脈輸注維持麻醉，保持家兔肢體無體動，呼吸、心率平穩。環甲膜做T形切口，插入氣管導管，接上動物呼吸機行機械通氣。分離胸前皮膚，打開胸腔，暴露心臟。直流電約20mA，正極在右心房，負極在左心室，行電刺激誘發室顫，直至有創血壓低于30mmHg，維持5min。手法心肺復蘇，直至有創血壓高于60mmHg，且能穩定維持為復蘇成功。另從右側耳緣靜脈泵入相應干預藥物。

1.3.2 給藥劑量 本實驗采用2種給藥劑量，即耳緣靜脈持續泵入依達拉奉液（由江蘇先聲藥業有限公司提供）1mg/（kg?h）， 3mg/（kg?h），對照組給予適量生理鹽水。

1.3.3 血清SOD、MDA含量測定 復蘇后30min、2h、4h分別抽取左側頸靜脈血液3mL，6h內離心（3000r/min）15min后棄去下層，取上層血清測定SOD、MDA含量。血清SOD含量測定采用黃嘌呤氧化酶法。血清MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法。以上嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統計學處理

所測數據以均數±標準差（χ±s）表示，采用SPSS13.0分析系統對定量數據進行組間t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 血清SOD含量比較

與N組比較，H組血清SOD含量明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05）；L組SOD含量開始升高不明顯，但隨著時間的延長也顯著升高。與L組比較，H組血清SOD含量明顯升高（表1）。

2.2 血清MDA含量比較

與N組比較，L組與H組血清MDA含量開始雖然降低，但差異無顯著（P＞0.05）。隨著時間的增加，H組血清MDA含量明顯降低，差異有顯著性（P＜0.05），L組MDA含量也顯著降低（P＜0.05）。與L組比較，H組血清MDA含量明顯降低（表2）。

3 討論

心肺復蘇后引起的一系列病理生理變化均可導致復蘇后全身性炎癥反應綜合征，繼而發生多臟器功能障礙綜合征，直接影響著復蘇的預后。腦組織較其他臟器更易遭受缺血缺氧性損害，復蘇后存在腦損傷、腦缺血缺氧等病理情況以及體內酶系統保護作用減弱，氧自由基生成過多。腦內產生的大量氧自由基通過脂質過氧化作用及與膜蛋白的反應造成腦細胞、血腦屏障的過氧損傷，導致細胞毒性、血管源性腦水腫，加劇腦的繼發性損害。

監測血清SOD、MDA水平對研究心肺腦復蘇后缺血缺氧情況有重要意義。SOD作為內源性氧自由基清除劑的代表，其活力在一定程度上反映了內源性氧自由基的清除活力，大量SOD對缺氧缺血性腦損傷有明顯保護作用[6]。MDA是自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，代表氧自由基的含量，測定MDA含量可以反映出組織含有氧自由基的多少[7]。本實驗結果顯示：H組血清SOD含量明顯升高，L組血清SOD含量升高不如H組明顯，說明大劑量依達拉奉治療產生的大量SOD對心肺復蘇后的腦保護作用顯著。依達拉奉治療后血清MDA含量明顯降低，說明氧自由基含量明顯減少，從而減輕腦損傷。

依達拉奉是親脂性基團，對血腦屏障的通透率為60%。作為一種新型自由基清除劑，它通過提供一個電子給自由基，從而清除體內活性氧分子，抑制脂質過氧化[8]，同時也保護血管內皮細胞，抑制遲發性神經細胞死亡，從而減輕神經細胞損傷[9]。

目前依達拉奉已廣泛用于臨床治療缺血性腦血管病，通過清除自由基，抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性，降低羥自由基的濃度，減輕腦損傷，對缺血的腦組織發揮神經保護作用。結果證實，心肺復蘇后靜脈注射依達拉奉液對心肺復蘇后家兔有一定腦保護作用，且呈劑量依賴關系，為其在心肺復蘇后對患者臨床治療中的應用提供了理論依據。

[參考文獻]

[1] 姜德華，金男革，玄漢石，等. 大鼠急性局灶性腦缺血再灌注腦組織NO含量和NOS活性的變化[J]. 臨床神經病學雜志，2000，13：201.

[2] Eiichi O. Effect of a novel free radical scavenger，Edaravone（MC1-186），on acute brain infarction[J]. Cerebrovasc Dis，2003，15（3）：222-229.

[3] Zhang N，Komine-Kobayashi M，Tanaka R，et a1. Edaravone rduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammtory responses after transient focal ischemia in mice brain[J]. Stroke，2005，36（10）：2220-2225.

[4] 黃唯佳，李章平，陳壽權. 心肺腦復蘇動物模型[J]. 中華急診醫學雜志，2002，11（6）：419-420.

[5] Idris AH，Becker LB，Ornato JP，et al. Utstein style guidelines for uniform reporting of laboratory CPR research[J]. Circulation，1996，94：2324-2336.

[6] Lee BI，Chan PH，Kim GW. Metalloporphyrin-based superoxide dismutase mimic attenuates the nuclear translocation of apoptosis-inducing factor and the subsequent DNA fragmentation after permanent focal cerebral ischemia in mice[J]. Stroke，2005，36：2712-2717.

[7] 王萬鐵，徐正怠，林麗娜，等. 心肌缺血再灌注損傷時MAP與MDA的相關分析[J]. 溫州醫學院學報，1997，27（2）：76-78.

篇（7）

一、“突破遼西北”戰略中生態環境保護的地位分析

2015年2月3日，《遼寧省人民政府關于進一步深入實施突破遼西北戰略的意見》出臺并再次強調，“十三五”期間，推進生態環境保護，著力實現綠色發展是突破遼西北戰略的重點任務之一。

在實施“突破遼西北”戰略過程中，要正視資源環境承載力。加強環境保護和生態建設，是突破遼西北區域發展戰略的重要保障。

二、遼西北農業生態環境保護法律制度體系方面存在的問題

遼西北地區長期以來工業發展相對緩慢，再加上該區域農業經濟的粗放經營導致水土流失、土地沙化、水資源浪費等生態破壞加劇，資源環境承載力極其脆弱。脆弱的生態環境極大地制約該地區的經濟社會發展。遼西北地區農業生態環境保護法律制度體系方面存在的問題，主要表現為：

1、在立法上，農業生態環境保護法律體系不健全?！吨腥A人民共和國環境保護法》為主體的環境保護法律體系雖已初步建立，但其對農業環境保護的規定缺乏，使得許多農業生態環境保護工作難以開展。

2、在執法層面，執法手段和措施單一。農業生態環境保護領域統分結合的分層管理體制效率低下，且極易導致各執法部門互相推諉和爭權奪利現象產生。農業主管部門和環保部門都可以行使行政執法權，加之地方保護主義導致的執法不嚴、違法不究等違法失職現象，使得農業生態環境保護陷入一個異?；靵y和尷尬的局面。

3、在運營環境上，相關制度協調性較差。許多生態環境法律制度雖已建立，但制度之間的配套性和協調性較差。在有關農業生態環境保護方面，缺乏必要的制度保障，如土壤污染防治、農業生態環境保護公益訴訟制度等。

4、在法律歸責上，涉及生態環境保護的禁止性規定與法律責任規定不協調，法律責任規定相對較為寬泛不夠嚴苛，使得現行環境保護法律法規既不足以震懾違法的當事人，也不能發揮應有的警示作用。

5、在法律監督上，相關部門認識，行政管理手段單一，過分偏于經濟處罰，缺乏對于建立長遠有效的法律監督機制的重視，致使農業生態環境遭到破壞，嚴重威脅當地農業經濟社會的可持續發展。

三、完善遼西北農業生態環境保護法律體系的建議

遼西北生態環境保護法律體系所存在的問題使得改善該區域農業生態環境顯得尤為重要。只有完善農業生態環境保護法律體系，才能更好的發展遼西北地區的農業經濟，走可持續發展道路。

1、制定統一的農業生態環境保護法

面對遼西北地區農業生態環境的困境，應制定統一的《農業生態環境保護法》，以法律文件的形式規范對于農業生態環境管理;通過對現行環保法的修訂，完善對于農業生態環境保護的專項規定。

2、強化農業生態環境保護執法力度

“天下之事不難于立法，而難于法之必行?！盵1]在農業生態環境保護領域，建立垂直管理體制，以求增強管理和執法效率，避免部門間相互推諉和扯皮的現象的發生。通過賦予農業生態環境保護管理部門較多的行政許可、行政強制和行政處罰權，來增強其執法和管理權威;此外，應嚴厲打擊地方保護主義，嚴格執法，對危害農業生態環境的違法犯罪行為，加大行政和司法打擊力度，加強執法和司法保護。

3、明確農業生態環境違法行為的法律責任

農業生態環境保護中“無法可依”的現象層出不窮。因此，農業環境保護法必須對污染和破壞農業生態環境的行為作出相應的處罰規定，加大處罰力度，完善相關處罰指標體系，從重從嚴處理相關違法行為，保證農業生態環境保護管理工作的有序運行開展。

4、采用統一監督管理與分工負責相結合的農業生態環境保護監督管理體制

信息不公開、不對稱是妨礙公眾參與環境保護工作的重要根源。要不斷完善農業生態環境信息公開立法，積極構建我國農業生態環境公開法律體系。“讓權力在陽光下行使”，才能使得我國農業生態環境保護工作在公眾的參與下得到有效監督。

結語

“突破遼西北”戰略有利于提升全省經濟整體實力，促進區域發展，也踐行國家政策。因此，在這一過程中，要高度重視農業生態環境的保護工作，為經濟社會的持續健康可持續發展提供十足的動力。（作者單位：沈陽師范大學法學院）

參考文獻：

[1] 陳葉蘭.論農業生態環境保護的良法之治.求索.2008.

[2] 韓廣.楊興.陳維春.中國環境法的基本制度研究.中國出版社.

[3] 張銑濤.我國農業生態環境立法現狀及對策.當代生態農業.2009（21）.

[4] 汪志革.農業生態環境保護的對策研究..科技資訊.2010（16）.

篇（8）

【關鍵詞】  槲寄生生物堿；P53；RT-PCR；人肝癌細胞株SMMC-7721

   

Abstract  Objective：To examine the effects of mistletoe alkali on P53 expression in Human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Methods:MTT assay was used to evaluate the inhibitory effects of mistletoe alkali on the proliferation of human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. RT-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique was used to evaluate P53 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Results:Mistletoe alkali significantly inhibits the growth of SMMC-7721 cells in a time and dose-dependent manner. After exposure of SMMC-7721 cells with mistletoe alkali at 0.100mg/mL for 24 hours, the relative intensity of P53 mRNA expression level as determined by RT-PCR increases markedly (P＜0.01). Conclusion:The stimulation of the expression of anti-oncogene P53 by mistletoe alkali may underlie the molecular basis for it to inhibit tumor growth

  

Key words  Mistletoe alkali； P53; RT-PCR； Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤的第二位[1]，且原發性肝癌具有起病隱匿、進展迅速、高度惡性、易轉移復發、治療難度大、生存期短等特點，被稱為“癌中之王”[2]。目前肝癌以外科手術為首選治療方案，但術后5年生存率并不理想，總體只有62.9%，大肝癌術后5年生存率僅34.6%。近年來應用傳統的中藥治療日益受到重視。槲寄生為桑寄生科植物槲寄生［Viscum coloratum(Komar)Nakai］的干燥帶葉莖枝，其味苦、平，歸肝、腎經，有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎作用[3] ，且槲寄生有較好的抗腫瘤效果[4] 。本文從分子水平探討槲寄生抑制肝癌的機制。

1  材料與方法

在哪

1.1  材料

1.1.1  細胞株  人肝癌細胞SMMC-7721，購于中國科學院上海細胞研究所。

1.1.2  主要試劑和儀器  RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青公司)，二甲基亞砜、MTT(Amersco)，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（寶生物公司），瓊脂糖（Promega），引物（上海生工）、Forma CO2培養箱（美國），ELX-800酶標儀（美國），Enpddorf低溫離心機（德國），PCR儀(美國)，紫外分光光度計（日立），倒置顯微鏡、凝膠成像系統（上海康樂）。

1.1.3  藥物  槲寄生購于包頭益仁堂中藥房，山西醫科大學藥學系揚官娥教授鑒定該中藥為槲寄生并非其他寄生。槲寄生生物堿由本校化學教研室予以提取。將提取物以碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑檢驗呈陽性反應，證明提取物為槲寄生生物堿。

1.2  方法

1.2.1  體外細胞培養  細胞培養于含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養基中, 37℃、5%CO2培養箱中培養,每2天換液1次。

1.2.2  MTT法測定槲寄生生物堿對肝癌細胞增殖的影響  取對數生長期的肝癌細胞調整至1×105/mL，取0.200mL接種于96孔板，置37 ℃、5%CO2培養24h后棄原培養液,加入濃度為0.200mg/mL、0.100mg/mL、0.050mg/mL、0.025mg/mL槲寄生堿培養液各0.200mL，每個濃度設6個復孔，分5次重復，并設陰性對照、5-Fu陽性對照（10μg/mL）和空白對照孔，同時作3個板。分別作用 24h、48h、72h后傾去上清液,用D-Hanks洗滌2次，各孔加入5%MTT 0.020mL，37℃4h后吸去上清液,加入DMSO 0.150mL,振蕩10min使結晶充分溶解后上酶標儀490nm處測吸光度A值。抑制率(%)=(對照孔A值-實驗組A值)/對照孔A值×100 %。依據MTT結果用改良寇氏法計算IC50。

1.2.3  槲寄生生物堿對人肝癌細胞SMMC-7721P53 mRNA表達影響的測定  （1）細胞給藥：取對數生長期的SMMC- 7721細胞調整至2×105/ mL,2.500mL接種于6孔板,置37℃、5 %CO2培養箱，培養24h后棄原培養液,對照組加入不含藥物的培養基2.500mL，試驗組依據MTT結果加入含濃度為0.100mg/mL槲寄生生物堿培養液2.500mL培養24h(抑制率為38%)。（2）總RNA的提取：用RNAiso Reagent提取試劑,經氯仿抽提、異丙醇沉淀，分別提取實驗組和對照組細胞總RNA。提取的總RNA用紫外分光光度計在260nm和280nm下檢測其吸光度值，以A260nm/A280nm比值表示其純度。（3）引物設計：參考文獻[5-6] 及GenBank中基因序列設計引物。P53上游引物：5′-TGTCCCCGGACGATATTGAAC-3′，下游引物：5′ -TTCCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。（4）RT-PCR反應：逆轉錄取總RNA 1μL按反轉錄試劑盒要求配成10μL反應體系，實驗組和對照組分別進行逆轉錄PCR反應。轉錄條件為30℃ 10min、50℃ 20min、99℃ 5min、5℃ 5min，共一個循環。（5）PCR反應：β-actin擴增條件: 94℃預變性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環,72℃延伸8min。P53擴增條件：94℃預變性2min，94℃30s，56℃30s,72℃1min,35個循環,72℃延伸8min。

1.2.4  半定量分析  將擴增的RT-PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳45min。電泳結束后在紫外透射儀下觀察電泳條帶,于凝膠成相儀上進行目的條帶的密度定量,以目的基因條帶的密度與內參β- actin的密度之比作為該目的基因的mRNA的相對含量。

1.2.5  統計學處理  實驗結果用SPSS 11.5統計分析軟件處理，數據用x±s表示，行t檢驗,以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2  結果在哪

2.1  槲寄生生物堿對細胞增殖的影響  槲寄生生物堿對SMMC-7721細胞有顯著生長抑制作用，且呈劑量和時間依賴方式，0.100mg/mL和0.200mg/mL濃度組在24h、 48h、72h均表現出抑制SMMC-7721細胞生長作用，抑制率分別為38%、52%、75%和52%、74%、93%，且作用強于5-Fu。 0.050mg/mL組及0.025mg/mL組也表現出抑制SMMC-7721細胞生長作用，在3個時間點抑制率分別為9%、21%、49%和0%、5 %、23%，但作用弱于5-Fu。

2.2  RT-PCR結果

2.2.1  總RNA抽提結果  所提取RNA經紫外分光光度計檢測A260nm/A280nm比值為1.8，說明提取的樣品為較純的RNA。

2.2.2  槲寄生生物堿對人肝癌細胞SMMC-7721 P53 mRNA表達的影響  0.100mg/mL槲寄生生物堿作用24h后能增強人肝癌細胞SMMC-7721 P53 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。電泳及P53 mRNA/β-actin mRNA半定量見圖1及表1。

圖1  槲寄生堿對肝癌SMMC-7721細胞P53 mRNA表達的影響（略）

M為Marker，1、3為對照組，2、4為藥物組，1、2為P53，3、4為β-actin內對照

表1  槲寄生堿對肝癌SMMC-7721細胞P53 mRNA表達的影響（略）

*與對照組比較P<0.01

3  討論在哪

  

槲寄生是我國傳統中藥，分布廣泛，在我國主要分布在東北、華北地區，資源豐富。為了開發利用天然資源，國內外的學者作了大量的工作。目前證實槲寄生有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調節、抗氧化、抗衰老等作用。目前研究較多的是槲寄生苷類的結構及槲寄生毒肽的抗腫瘤作用，對生物堿的研究不多。彭海燕等[7]的研究表明槲寄生生物堿在120mg/kg計量時對小鼠肝癌H22 的抑瘤率可達73.8%。腫瘤抑制基因是腫瘤遺傳學及分子生物學的研究熱點。P53基因與腫瘤關系最為密切。野生型的P53基因產物監控基因組的完整性，當DNA受到損傷時，野生型P53產物通過轉譯后的穩定作用，蓄積、促進細胞周期停留在G1期，用這額外的時間進行修復[8]。野生型P53基因的結構和表達異常是肝癌中最多的基因改變之一[9]。

  

本實驗從分子水平探討槲寄生生物堿的作用機理與基因表達的關系。我們選擇了與腫瘤發生關系密切的基因P53作為研究對象，檢測其mRNA的表達。研究發現，槲寄生生物堿0.100mg/mL作用于肝癌細胞株SMMC-7721 24h后，野生型P53表達增強。這表明槲寄生生物堿可能激活抑癌基因P53而使癌細胞死亡從而發揮其抗腫瘤作用。對于槲寄生生物堿作用后其他濃度及時間點基因表達的改變有待繼續研究。

【參考文獻】

 

[1] 中華人民共和國衛生部.1995中國衛生統計提要[C].中華人民共和國衛生部，1995：73.

[2] 張健，趙秀麗，翟玉萍.原發性肝癌中醫藥治療進展[J].內蒙古中醫藥，2004,（6）:35-36.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學工業出版社，2005:258.

[4] 王慶瑞,劉梅筠,王東陽，等.槲寄生總生物堿的抗腫瘤作用[J].中國中藥雜志.1994,19(1):45-47.

[5] Khan ZA,Jonas SK,Le-Marer N,et al.P53 mutations in primary and metastatic tumors and circulating tumor cells from colorectal carcinoma patients[J].Clin Cancer Res,2000,6(9):3499-3504.

[6] Selvakumaran M,Lin HK,Miyashita T,et al.Immediate early upregulation of Bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways[J]. Oncogene，1994，9:1791-1798.

[7] 彭海燕,章永紅,韓英,等.槲寄生堿抗肝癌作用試驗性研究[J].實用中醫藥雜志，2004， 20(5):227-228.

篇（9）

【關鍵詞】 金絲桃素　慢性高眼壓　視網膜神經節細胞　神經保護　兔

The histology observation on the protective effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits

Abstract AIM: To explore the effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits. METHODS: Twenty rabbits were used to build chronic ocular hypertension model by posterior chamber injection of alpha-chymotrypsin. Ten days after successful model creation， hypericin 0.1mL or saline 0.1mL was injected into the vitreous cavity once a week for 2 weeks. Retinal ganglion cell of these eyes and that of four normal rabbit eyes were observed by light microscopy and electron microscopy. The thinckness of inner retina layer was examined.RESULTS: The number of retinal ganglion cell in saline-treated group decreased significantly. There was serious cell degradation with perinuclear condensation of chromatin and swelling organelles， but the change was slight in hypericin-treated group. The difference of the thickness of inner retina layer between the two groups was significant (P＜0.01).CONCLUSION: Intravitreal injection of hypericin as a protein kinase C antagonist can protect the retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits.

· KEYWORDS: hypericin; chronic ocular hypertension; retina ganglion cell; nerve protection; rabbits

0引言

青光眼是一組與眼壓升高有關的致盲性眼病。它的病理基礎是視網膜神經節細胞進行性死亡。目前青光眼的治療主要是降眼壓，但是單純降眼壓并不能阻止視功能的繼續下降。隨著視神經保護理論的提出和研究，視神經保護治療越來越受到人們廣泛的關注[1]。我們就是基于視神經保護治療的理論，探討一種蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制劑——金絲桃素對視網膜神經節細胞的保護作用。

1材料和方法

1.1材料 健康成年家兔24只，體質量2.0~2.5kg，無眼疾，雌雄兼用，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。金絲桃素和二甲基亞砜(sigma公司)、注射用糜蛋白酶（上海第一生化藥業有限公司）、LZL-12型手術顯微鏡（鎮江中天光學儀器有限責任公司）、Tonopen筆式眼壓計（Medtronic Solan公司）。

1.2方法 健康成年家兔24只，隨機挑選20只作為實驗組，另4只作為對照組。實驗組用200g/L烏拉坦5mL/kg，3min內注入耳緣靜脈全身麻醉，每只兔隨機選一眼作實驗眼，的卡因點眼局部麻醉。用1mL注射器抽取400U 糜蛋白酶溶液0.2mL，從顳側角鞏膜緣進針，經瞳孔至對側虹膜下注入后房，四環素眼膏涂眼。每日用Tonopen眼壓計測眼壓，眼壓在30mmHg（1mmHg=0.133kPa）以上為慢性高眼壓造模成功[2]。待高眼壓模型眼壓穩定升高10d后，隨機挑選半數的高眼壓兔作玻璃體內金絲桃素注射。金絲桃素用二甲基亞砜溶解，生理鹽水稀釋，終濃度為2μmol/L， 避光保存。實驗兔烏拉坦全身麻醉加的卡因局部麻醉，在顯微鏡下用2mL注射器，從12點鐘角膜緣后3mm處睫狀體平坦部進針，抽出玻璃體0.1mL，注入金絲桃素0.1mL。1次/wk，連續2wk。另一半高眼壓兔同上法操作，玻璃體內注入生理鹽水0.1mL。1次/wk，連續2wk。正常兔4只，不做任何眼部和全身的處理，處死后進行下一步實驗。第2次玻璃體注射后7d處死兔子，摘除眼球置于冰盒內，迅速去除眼前段，暴露并分離視網膜分別制作光鏡電鏡標本。光鏡標本經40g/L福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察并照相[3]。電鏡標本經30g/L的戊二醛和10g/L的鋨酸固定，乙醇丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛染色，電鏡觀察并照相[4]。觀察所有家兔視網膜光鏡下結構的變化并利用定量病理學的網格系統[5]，按J=LP．∑Pb/∑IA+∑Ib，計算視網膜內界膜至外核層內側間的距離，以5次平均值(MTIRL)作為視網膜內層平均厚度[6]。

統計學處理:應用SPSS 11.0統計軟件進行統計學處理，結果用 表示

2結果

我們采用后房注射α－糜蛋白酶的方法制備兔慢性高眼壓模型。此方法高眼壓發生快、持續時間長、眼壓穩定。采用20只兔作為實驗組造模，最終16只成功，其中一只因麻醉過量死亡，3眼壓未達到預期水平，成功率為80%。造模后眼壓一般在術后1wk內升高，實驗眼呈牛眼狀外觀，眼球變硬，睫狀充血，角膜水腫，前房加深，瞳孔散大。Tonopen筆式眼壓計測得平均眼壓為(34.12±2.31) mmHg，高眼壓狀態至少可維持2mo。

2.1光鏡觀察 光鏡下見正常兔的視網膜組織結構清晰、完整，可觀察到10層結構，外核層細胞數量最多，內核層細胞數量較少，節細胞為單層，形態呈類圓形（圖1A）。生理鹽水對照組視網膜內層變薄，神經節細胞數量明顯減少，細胞出現變性，內、外核層細胞排列稀疏，數量減少（圖1B）。金絲桃素治療組損傷明顯輕于生理鹽水對照組，神經節細胞數量有所減少，胞核大部分存在，部分出現空泡樣變，內核層和外核層結構與正常組所見相似（圖1 C）。

2.2電鏡觀察 透射電鏡下見正常視網膜神經節細胞核呈類圓形，染色質顏色清晰，分布均勻，內質網、線粒體等細胞器形態正常，細胞膜完整(圖2A) 。生理鹽水對照組神經節細胞明顯減少，部分細胞嚴重變性，核結構稀疏，核仁固縮及偏位，胞質染色質邊集，內質網腫脹，線粒體腫脹，嵴消失，空泡變性（圖2B）。金絲桃素治療組見部分核稍有變形，核染色質略顯稀疏，顏色稍淡，線粒體空泡變性，殘存線粒體嵴， 內質網僅見輕度腫脹（圖2C）。視網膜內層平均厚度正常組為78.62±1.87μm， 金絲桃素治療組為73.80±5.61μm， 生理鹽水對照組為59.30±2.17μm。后兩者相比有顯著性差異(P＜0.01)。

圖 1 兔視網膜神經節細胞 (HE×200) A：空白對照組正常；B:生理鹽水對照組數量明顯減少，出現變性；C：金絲桃素治療組數量減少，胞核大部分存在

圖 2 兔視網膜神經節細胞超微結構(TEM×106) A：空白對照組核居中，細胞器形態正常，細胞膜完整；B：生理鹽水對照組核仁固縮，胞質染色質邊集，線粒體、內質網等細胞器腫脹；C：金絲桃素治療組核染色質濃集，線粒體空泡變性，殘存線粒體嵴

3 討論

在臨床上作為一種抗病毒藥、抗抑郁藥應用的金絲桃素是一種PKC的特異性抑制劑，是從金絲桃家族中提取的一種紫色結晶顏料[7]。目前已經有研究表明，金絲桃素對增生性玻璃體視網膜病變也有治療作用[8]。通過本實驗我們觀察到，應用金絲桃素玻璃體內注射，視網膜神經節細胞的形態結構相比生理鹽水對照組損傷明顯減輕，視網膜內層平均厚度也比生理鹽水對照組厚。這說明金絲桃素可以直接增強節細胞對抗有害因素的能力，促進受損細胞的存活和功能恢復。

青光眼的主要危險因素之一是病理性眼壓升高。慢性高眼壓對視網膜神經節細胞損傷的機制主要是因為眼壓升高迫使篩板組織變形，使得節細胞軸漿流受阻于篩板，由此引起逆行運向神經節細胞胞體的神經營養性因子減少，神經節細胞釋放谷氨酸，細胞外間隙谷氨酸蓄積，節細胞發生凋亡[9-12]。本實驗中生理鹽水對照組節細胞數量明顯減少，部分嚴重變性， 核仁固縮，胞質染色質邊集，線粒體、內質網等細胞器腫脹就是細胞凋亡的早期表現。PKC是一類鈣、磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以通過一系列信號級聯反應對谷氨酸受體和谷氨酸轉運蛋白進行具有濃度和劑量依賴性的調節，使得細胞外間隙谷氨酸蓄積的同時，增強谷氨酸與其受體的作用，最終增加受體介導的興奮毒性，導致視網膜神經節細胞的凋亡[13，14]。反之，PKC抑制劑則可拮抗這一作用。我們已經用實驗證實了慢性高眼壓兔不同時間點的視網膜谷氨酸含量都比正常值有所升高，而PKC抑制劑金絲桃素能拮抗這一作用。金絲桃素對視網膜神經節細胞組織學的保護作用，很可能是通過PKC抑制劑對視網膜谷氨酸含量的抑制這一機制來實現的。當然對于青光眼這種慢性疾病來說，反復玻璃體內注射，也是有其明顯的不良后果的。因此，探討金絲桃素的作用和調控機制，研究如何發揮其對青光眼視神經保護的治療潛力，有待于我們今后進一步研究。

參考文獻

1王艷.青光眼視神經保護治療的實驗研究. 眼科新進展，2002;22(3):16-18

2 Sears D， Sears M. Blood-aqueous barrier and alpha-chymotrypsin glaucoma in rabbits. Am J Ophthalmol ，1974;77(3): 378-383

3項敏泓，鐘一聲，張興儒. 燈盞細辛對兔高眼壓視網膜神經節細胞活性的作用. 眼科新進展，2005;25(5):414-416

4原慧萍，褚利群，王莉娜，王雅. 兔實驗性高眼壓視網膜神經節細胞的凋亡. 眼科研究，2004;22(2):180-182

5申洪，沈忠英，主編.實用生物體視學.廣州:中山大學出版社，1991:113-114

6 Takahashi K， Lam T，Edward P，Buchi R Tso O.Protective effects of flunarizine on ischemic injury in the rat retina. Arch Ophthalmol ，1992;110:862-870

7Agostinis P，Assefa Z，Vantieghem A， Vandenheede JR， Merlevede W， Witte P De. Apoptotic and anti-apoptotic signaling pathways induced by photodynamic therapy with hypericin. Adv Enzyme Regul ，2000;40:157-182

8高前應，惠延年，王雨生.金絲桃素抑制兔外傷性增生性玻璃體視網膜病變.眼科學報，2002;18(4):240-245

9王建洲，賀翔鴿，謝琳，岳紅云，孫亞麗.Nogo蛋白在正常大鼠視神經視網膜的表達.國際眼科雜志，2006;6(6):1302-1304

10石晶明，蔣幼芹.興奮性氨基酸與青光眼. 國際眼科雜志，2004;4(4):668-674

11 Quigley HA. Ganglion cell death in glaucoma:pathology recapitulates ontogeny. Aust NZ J Ophthalmol ，1995;23(2):85-91

篇（10）

What people wear glasses fast increase? The question in my mind kept wandering. Later, I looked at a very long time, also check the information from the Internet, finally reached the conclusion. The first big reason: no scientific methods to protect their eyes. Some classmates for a long period of time reading books, watching TV, Internet access, make the eye often is in a state of fatigue, and do not pay attention to eye health. Although our school asked the students are doing eye exercises on time, but part of the students or not to do a good job, some still hiding under the table. The second reason: genetic. Some parents are nearsighted, and pass on to their children. But this kind of situation seems to be not much, "small glasses," often because not sparing eyes.

Finally, counsels: we must cherish oneself only this pair of eyes, to make our every day is full of light!

眼睛是心靈的窗口，是獲得各種知識的重要途徑。生活中我們處處都離不開眼睛，如果沒有眼睛，世界將會變得一片黑暗，如果我們的眼睛出了問題，學習和生活將會遇到很多困難。盡管這樣，我們有很多人還是不愛惜眼睛。在我的周圍，已經有越來越多的同學帶上了“小眼鏡兒”，我的視力也逐漸下降，后來被醫生診斷為假性近視。所以，保護眼睛這一點也被越來越多的人們重視起來。